平喘方干预哮喘模型观察“IL-33-ST2”肺肠免疫变化的研究①

朴 香 吴 杰 虞坚尔 薛 征 徐万超 （上海中医药大学附属市中医医院，上海 200071）

过敏性哮喘以嗜酸性粒细胞介导的呼吸道炎症和气道高反应性为主要特征，是以Th2 占优势的免疫紊乱性疾病［1］。目前全球约有3 亿哮喘患者，中国约有3 000 万，其中约1/3 为儿童。在哮喘患儿中，有70%首次发作在3 岁以前，1 岁以前发病率占28.42%，其发病率逐年增高，严重威胁儿童的生长健康，给家庭及社会带来多方面负担。哮喘的固有免疫可由肠道微生物介导肠道组织IL-33 免疫反应，通过IL-33/ST2 通路进行远端调控。因此，哮喘发作可能与肠道免疫紊乱有关。海派徐氏儿科传承人虞坚尔教授认为哮喘患儿急性期病机多因宿痰内伏为发病根本，治疗大法以平喘化痰，祛瘀通腑为主，一方面选用宣肺平喘经方“三拗汤”联合温肺化痰方“三子养亲汤”共奏平喘化痰之功，另一方面灵活运用有通腑之效的莱菔子、桃仁，不仅能祛瘀，又能通腑。前期临床试验发现，平喘方控制儿童哮喘发作疗效显著，其治愈率高于氨茶碱［2］。前期动物实验发现平喘方能够调节Th1/Th2 平衡，并能够减轻哮喘急性发作气道炎症［3-4］，但其控制哮喘发作的具体机制仍不明确。因此，本部分通过IL-33/ST2 通路观察平喘方干预哮喘模型，观察其在肺肠组织免疫调节的机制研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 40 只5~6 周BALB/c 雌性小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限公司［许可证号：SCXK（沪）2017-0005］，饲养于上海中医药大学附属市中医医院SPF 环境中，温度22~24 ℃，湿度为50%~70%，模拟12 h 日光灯昼夜更替。使用灭菌水和标准鼠粮饲养。开始研究前，各组小鼠适应性喂养7 d。

1.1.2 主要试剂 卵清白蛋白（ovalbumin，OVA，纯度≥98%，Sigma，型号：A5503）；铝佐剂（Thermo-Fisher，型号：77161）；苏木素溶液（BASO，型号：714094）；伊红（BASO，型号：BA4099）；IL-5、IL-13、IL-33 ELISA 试剂盒（X-Y Biotechnology，型号：XYE20193、GS-E11384、XY-B980Mu）；兔多克隆 IL-33抗体、兔多克隆ST2 抗体；兔多克隆HNF1A 抗体、兔多克隆 GATA3 抗体、兔多克隆 IκBα、兔多克隆NFKB1 抗体、鼠多克隆NFKBp65 抗体（Proteintech，型号：12372-1-AP、11920-1-AP、22426-1-AP、10417-1-AP、10268-1-AP、14220-1-AP、10745-1-AP）；羊抗鼠HRP 标记二抗（碧云天，型号：A0216）；逆转录试剂盒（Fermentas，型号：K1622）；Trizo（lInvitrogen，型号：1596-026）；BCA 蛋白定量试剂盒（ThermoFisher，型号：K0223、PICPI23223）。

1.1.3 实验药物配制 地塞米松：醋酸地塞米松片（0.75 mg/片，上海通用药业股份有限公司，批号为061002），加生理盐水配制成浓度为0.075 mg/ml的溶液，等量灌胃；1次/d，连续给药7 d。

平喘方：炙麻黄 6 g、大桃仁 9 g、苦杏仁 9 g、炙甘草6 g、紫苏子9 g、莱菔子9 g、地龙干6 g、花椒目9 g。生药饮片均购自上海市药材公司，参考文献［5］的方法煎煮提取药物，浓缩干燥为颗粒剂。其鉴定及质控均委托上海中医药大学药物研究所完成。加生理盐水配制成浓度为含生药量剂量为5.33 g/ml，根据《中药药理学》中公式：dB=dA×KB/KA 计算，以20 ml（/kg·d）灌胃。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 根据前期实验基础，BALB/c 小鼠分为4 组（n=10）：空白对照组、模型组、地塞米松组（DEX）和平喘方组（PCF）。

1.2.2 模型建立 ①致敏阶段：除空白对照组外其余各组分别在实验的第0、13 天腹腔注射0.5 ml OVA-A（lOH）3致敏液，空白对照组腹腔注射等剂量的生理盐水。第二次腹腔注射1 周后，开始激发阶段；②激发阶段：第20~27天雾化激发。将小鼠置于密闭容器中，将5%OVA 致敏液用超声雾化激发，连续7 d，1 次/d，每次30 min。对照组用生理盐水做相对应处理，以小鼠出现烦躁、搔鼻、呼吸加快、腹肌痉挛、点头呼吸及四肢瘫软等表现为激发成功。

1.2.3 HE 染色 处死小鼠后取肺脏组织固定在4%多聚甲醛中，切成0.2~0.3 cm，大小为1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 的切片。冲洗后，用梯度乙醇（50%、70%、85%、95%直至无水乙醇）逐级脱水，每级2 h。重复冲洗，脱水后，浸蜡包埋。按照HE 步骤染色，在显微镜下观察肺支气管旁和血管炎症病理变化以及结肠组织变化。

1.2.4 ELISA检测炎症因子 冻存的BALF上清用于细胞因子的测定，利用ELISA 法检测支气管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13 和IL-33 的表达水平。参照试剂说明书操作。

1.2.5 RT-PCR 用TRIzol试剂按照标准从肺脏和结肠组织中提取总RNA。cDNA 第一条链的合成，将制备好的cDNA 进行RT-PCR 扩增，扩增引物如表 1。用循环阈值 Ct 测量表达水平，然后用 2-ΔΔCt方法将其归一化为GAPDH表达。

1.2.6 Western blot 分别提取肺脏和结肠组织的总蛋白，取50 μg 蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min 后离心取上清，上样到PAGE 凝胶电泳槽中分离蛋白，转至半干转膜中，用丽春红染色检测转膜是否成功。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，根据说明书分别稀释一抗（anti-IL-33、anti-ST2、anti-GATA、anti-p50、anti-p60），与膜室温孵育2 h。孵育一抗的膜用TBST 洗涤3 次，每次5 min。随后根据用量，按照1∶1 000稀释HRP标记的二抗，与膜37 ℃孵育1 h。用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 min。用 ECL 化学发光显色，在成像系统中进行扫描拍照。用Image J软件统计灰度值计算相对表达量。GAPDH内参，至少进行3个独立重复实验。

2 结果

2.1 肺组织病理切片HE 染色 镜下观察：肺组织切片HE 染色观察支气管及血管周围炎症细胞浸润。与空白对照组相比，模型组支气管及血管周围出现大量的嗜酸性粒细胞浸润，气道管腔狭窄，基底膜增厚。与模型组相比，地塞米松组和平喘方组有效抑制气道炎症细胞浸润和炎症物质渗出，见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理切片HE染色（×200）Fig.1 Pathological observation of lung tissue of mice in each group by HE-staining（×200）

2.2 结肠组织病理切片HE 染色 镜下观察结肠组织切片HE 染色：空白对照组结肠组织可见肠壁紧密，腺体丰富，腺窝深，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则，结构清晰。而模型组肠壁变薄，腺体稀疏，腺体排列存在部分破坏，黏膜上皮欠缺，有部分细胞可见水肿破裂。与模型组相比，地塞米松组和平喘方组对肠道黏膜屏障具有保护作用（图2）。

图2 各组小鼠肠道组织病理切片HE染色（×200）Fig1 Pathological observation of gut tissue of mice in each group by HE-staining（×200）

2.3 肺泡灌洗液中IL-5和IL-13的表达水平 应用ELISA 检测支气管肺泡灌洗液中IL-5 和IL-13，结果见图3：与空白对照组相比，模型组表达明显上调（P＜0.05）；与模型组相比，地塞米松组和平喘方组的表达有显著下调（P＜0.05）；地塞米松组和平喘方组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。提示平喘方能有效抑制哮喘模型中IL-5和IL-13的表达，对气道炎症有抑制作用。

图3 支气管肺泡灌洗液中IL-5和IL-13的表达水平Fig.3 Expressions of IL-5 and IL-13 in BALF

2.4 肺肠组织中IL-33-ST2信号通路中相关因子的表达 机体受到外界环境各种刺激的作用下，引发气道上皮细胞释放IL-33，与Ⅱ型固有淋巴细胞上的ST2 受体（IL-1R1）结合，触发信号级联反应，最终激活NF-κB，驱动Th2 炎症反应。因此，为了证明平喘方能够干预哮喘模型中IL-33-ST2信号通路，本课题通过OVA 诱导的哮喘小鼠灌服平喘方，进一步探讨IL-33-ST2通路及其下游相关因子的表达。

2.4.1 IL-33-ST2 信号通路在各组小鼠的表达 上皮细胞释放的IL-33与Ⅱ型固有淋巴细胞上的IL-1R1结合，Ⅱ型固有淋巴细胞内的TCF-1 和GATA3 的释放，进一步促进Ⅱ型固有淋巴细胞成熟。用ELISA检测平喘方能够下调哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液IL-33 的表达（图4A）：与空白对照组相比，模型组IL-33 表达上调（P＜0.01）；与模型组相比，地塞米松组和平喘方组IL-33 表达下调（P＜0.05）；地塞米松组和平喘方组IL-33 表达差异无统计学意义（P=0.99）。同时在肺组织中也表达IL-33的mRNA和蛋白的下调（图4B~D，P＜0.05，P＜0.01），与其结合的ST2 受体在肺组织中表达也 下 调（P＜0.01，P＜0.05）。在Ⅱ型固有淋巴细胞内促进细胞成熟的TCF-1 和 GATA3 的 mRNA 表达下调（P＜0.05，P＜0.01，图 4B），GATA3 的蛋白表达下调（P＜0.01，图4D），但TCF-1 蛋白表达与模型组差异无统计学意义（P＞0.05，图4D）。提示地塞米松和平喘方可能通过抑制IL-33-ST2信号通路抑制哮喘气道炎症。

图4 IL-33-ST2通路相关因子的表达（n=3）Fig.4 Expressions of related factors on IL-33-ST2 pathway（n=3）

2.4.2 IL-33-ST2 信号下游的 NF-κB 通路在各组小鼠的表达变化 NF-κB 蛋白通常会由 p65 和 p50 形成同源/异源二聚体，在胞质中因与抑制蛋白IκBα结合形成了三聚体复合物而处于失活状态。在哮喘发作时，可因IL-33-ST2 信号通路被激活，经过级联反应最终导致NF-κB 蛋白被激活。前面已经观察到IL-33-ST2 信号通路可因平喘方干预哮喘而受到抑制，现进一步观察平喘方能否抑制NF-κB 信号蛋白。通过RT-PCR 观察（图5B）：与空白对照组相比，模型组IκBα表达下调（P＜0.01），p50和p65合成增多（P＜0.01）；与模型组相比，地塞米松组和平喘方组IκBα 表达上调（P＜0.05），p50 和p65 合成减少（P＜0.01）；地塞米松组和平喘方组两组差异无统计学意义（P＞0.05）。通过Western blot 观察（图5A、C）：与空白对照组相比，模型组IκBα 蛋白下调（P＜0.01），p50 和p65 蛋白增多（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组相比，地塞米松组和平喘方组IκBα蛋白表达上调（P＜0.01），但p50 和p65 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 NF-κB通路相关因子的表达（n=3）Fig.5 Expressions of related factors on NF-κB pathway（n=3）

2.4.3 结肠组织 IL-33、ST2 和 GATA3 mRNA 和蛋白的表达 通过RT-PCR和Western blot初步观察结肠IL-33、ST2 和GATA3 mRNA和蛋白的表达。结果显示（图6）：与空白对照组相比，模型组IL-33、ST2和 GATA3 表达均上调（mRNA：P＜0.01；蛋白：P＜0.01）；与模型组相比，地塞米松组（mRNA：P＜0.05；蛋白：P＜0.05），平喘方组（mRNA：P＜0.01；蛋白：P＜0.01）表达下调；地塞米松组和平喘方组两组比较差异无统计学意义（P＞0.05，图6）。

图6 IL-33-ST2 通路在结肠组织中mRNA 和蛋白的表达（n=3）Fig.6 Expressions of mRNA and protein on IL-33-ST2 pathway in colon tissue（n=3）

3 讨论

哮喘是一种常见的慢性疾病，目前影响全球超过3 亿人，预计到2025 年患病人数将增加到4 亿。每年约有25万人病死于哮喘相关疾病，其中许多是可以避免的［6］。哮喘的发病机制尚不清楚，但该疾病与遗传、环境、传染性和营养等因素有关。在20世纪初，哮喘被描述为一种单一疾病，但目前对其复杂性的理解已经发展到精确医学方法，包括微生物组分析，开始出现其诊断和治疗方法［7-8］。哮喘中肠道内的微生物失调可能是由许多与生活方式和环境暴露有关的因素引起的。肠道中共生和病理细菌株之间的不平衡可能导致免疫发育的改变和不适当的炎症反应，但仍不清楚不平衡是疾病的致病因素还是其他因素影响。有文献报道IL-33-ST2通路在哮喘发作过程和肺肠黏膜免疫中均有显著变化［9］。

IL-33是IL-1细胞因子家族的成员，主要来源于上皮细胞［10-15］，是过敏性炎症反应的中介，能够促进多种白细胞成熟、活化或趋化，包括Th2 细胞、肥大细胞、Ⅱ型固有细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞等［16-19］。IL-33 通过与ST2 受体（也称为IL-1R1）结合发挥生物学效应［20］。当机体受到外界环境各种刺激的作用下（包括细菌，病毒，真菌，过敏原和污染物），可以引发气道上皮细胞释放IL-33，与ST2L 的结合，募集信号衔接蛋白，如信号分子髓样分化因子 88（MyD88）和 Mal［21］。MyD88 和Mal 与 IL-1RL1-b 和 IL-1RAcP 的细胞 内 TIR 结构 域结合，触发信号级联反应，激活NF-кB 和激活蛋白1（activin-1，AP-1），促进 Th2 细胞免疫应答［8］。在过敏性哮喘小鼠模型中，体外给予IL-33 可产生气道嗜酸性粒细胞，上调Th2 细胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13 等）表达，并提高血清 IgE 水平，AHR（airway hyperresponsiveness）黏液分泌过多［22］。若用抗体阻断 IL-33/ST2 通路，能下调小鼠哮喘模型中Th2 型免疫应答，减轻气道嗜酸性粒细胞浸润及气道阻力［8］；此外，与健康对照组相比，成人和儿童急性哮喘的血浆和痰液中发现了高水平的ST2 和IL-33。有研究表明，IL-33/ST2 可影响儿童喘息发生及早期哮喘的发展［23-26］。在过敏性气道疾病的人体和小鼠模型中均发现，IL-33 驱动在Th2 炎症反应中起核心作用。

MJÖSBERG 等［27］研究表明，GATA3 对 IL-13 及ST2 的表达有调控作用，同时，GATA3 还是 Th2 效应细胞分化的关键调节器，编码染色体重排Th2 细胞因子基因座，从而诱导IL-5、IL-9、IL-13高水平表达，因此依赖IL-33-ST2-IL-13 轴，促进Th2 细胞免疫应答，分泌炎症因子。有研究发现，蛋白酶的活性损害过敏性哮喘的气道上皮细胞，释放IL-33，释放嗜酸性粒细胞，黏液分泌增加［26-27］。BARLOW 等［28］研究发现，相同小鼠通过上呼吸道接触花粉或卵清蛋白，IL-33是具有比IL-25更快、更有效地促进气道高反应性。KEARLEY 等［29］研究表明，OVA 诱导的过敏性哮喘中，持续性气道高反应与Th2 细胞持续分泌炎症因子有关，而不是肺嗜酸性粒细胞，其作用通路是ST2（IL-33R）-IL-33，用抗体阻断IL-33 的ST2受体可减少IL-13、IL-4 的分泌，减轻气道高反应性和气道黏膜炎症。

肺与大肠的黏膜上皮共同组成抵御外来抗原的第一道屏障，屏障完整性的维持和修复对于黏膜上皮炎症至关重要［14］。中医理论认为“肺与大肠相表里”，而肺-肠轴是其现代科学体现。HUANG 等［8］研究发现，ILC2s 不是专属驻留在肺组织细胞中，可以从肠道募集到肺等，以响应炎症信号的激活。而ILC2s 的激活是通过 IL-33 与 ILC2s 表面的 ST2 受体结合，同肺部IL-33-ST2相似，出现一系列级联反应，有研究报道，肠道黏膜被IL-33 诱导Ⅱ型免疫后，通过血液循环才在肺中出现，并在肺中快速、短暂地发生Ⅱ型免疫反应［8］。因此，本项目通过地塞米松和平喘方干预研究IL-33-ST2 途径所调节的肺肠黏膜炎症反应对调节“肺-肠”轴有重要意义。

研究结果显示，本项目平喘方和地塞米松均能有效干预哮喘小鼠肺部IL-33-ST2通路，其中下调上皮细胞IL-33 高表达，减少其与ST2 受体的结合，可能与GATA3 和TCF-1 的异常高表达有关，同时显示，肠道的IL-33-ST2通路也有相应的变化。提示平喘方和地塞米松均能调控肺肠的IL-33-ST2通路。

本实验哮喘小鼠的肺肠IL-33-ST2 通路异常表达，通过用地塞米松和平喘方分别干预哮喘小鼠发现，平喘方同地塞米松均能有效地下调哮喘的肺肠黏膜的炎症因子的表达。大量研究表明，哮喘患儿的肠道菌群失调，平喘方方组中莱菔子、桃仁，不仅能祛瘀，又能通腑［30］。本课题组前期预实验也发现，哮喘小鼠灌胃平喘方后，出现肠道双歧杆菌定植重新定植的效果，但其具体的作用机制仍需进一步研究发现。