红三叶叶蛋白浸提和絮凝条件的研究

李荣杰 刘信宝

（1.常州市动物疫病预防控制中心，江苏常州 213000； 2.南京农业大学草业学院，江苏南京 210095）

叶蛋白是将新鲜的植物茎叶粉碎打浆、水或酸（碱）溶液浸提、絮凝分离而提取出来的蛋白质。叶蛋白除含有18种氨基酸外，还含有糖、脂肪、多种维生素以及铁、镁、钙、锌、铜等多种矿物元素，是优质的蛋白质饲料。叶蛋白提取之后的草渣、草粉加工后可以添加为作为反刍动物的饲料，或者用做青贮原料；絮凝分离之后剩余的上清液可以提取超氧化歧化酶，也可以用于微生物培养或者直接用于畜禽养殖。因此，叶蛋白生产不仅可以为畜牧业提供优质的蛋白质饲料，还可以提高植物的利用效率，在生产上具有很好的发展前景。

叶蛋白生产受生产原料的蛋白质含量、原料粉碎后的浸提技术以及浸提液中蛋白质的絮凝技术等3个方面影响。牧草是生产叶蛋白的优质原料，资源丰富，产量高，尤其是豆科牧草，蛋白质含量高，提取容易。叶蛋白的浸提技术受浸提液料液比、浸提温度和浸提时间3个关键环节的影响，而絮凝技术受加热温度和加热时间2个关键环节的影响。

本研究选择优质豆科牧草红三叶作为试验材料，采用单因素和正交实验研究了料液比、浸提温度和浸提时间对叶蛋白浸出率的影响，确定红三叶叶蛋白浸提的适宜条件；在适宜的浸提条件下，通过测定在不同加热温度和加热时间条件下红三叶叶蛋白的絮凝率，确定适宜的絮凝条件。通过红三叶叶蛋白浸提和絮凝条件的研究，为叶蛋白生产提供理论依据，促进畜牧业稳定可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红三叶种子由湖北农科院畜牧所提供，于南京农业大学牌楼教学实验基地种植，现蕾期刈割作为试验材料。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 浸提液制备

按一定的料液比称取新鲜红三叶，加适量的水，用打浆机打碎后按照不同的浸提温度和时间在恒温水浴锅中浸提，达到预定时间后取出，纱布（3层）过滤。滤液于4℃、10000r/min条件下离心10min，得到上清液后测定其中蛋白质的含量，计算叶蛋白提取率。

1.2.2 单因素试验

浸提液制备：分别以料液比为1：10、1：15、1：20、1：25和1：30，浸提时间为20、30、40、50和60min，浸提温度为30、35、40、45和50℃进行单因素实验，测定叶蛋白含量，计算不同条件下的叶蛋白提取率。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验结果，确定适宜的料液比、浸提时间、浸提温度，进行3因素3水平正交试验，通过测定不同处理条件下的叶蛋白含量，筛选出红三叶最佳提取条件，确定影响叶蛋白提取率不同因素的重要程度。

1.3 蛋白质含量测定

考马斯亮蓝法。

1.4 数据统计与分析

Excel整理数据，SPSS20.0进行统计分析。

2 结果与分析

红三叶叶蛋白单因素提取：

2.1 稀释倍数

在浸提温度为40℃，分别稀释10、15、20、25和30倍，浸提40min制备红三叶浸提液，测定蛋白质含量，计算叶蛋白提取率。

结果表明，在固定的提取温度和提取时间时，红三叶稀释25倍叶蛋白提取率最高，达3.02%；稀释10倍叶蛋白提取率最低，为2.19%。稀释倍数小于25时，叶蛋白提取率随着稀释倍数增加而呈现升高趋势；稀释倍数大于25后，叶蛋白提取率呈现降低趋势。

2.2 浸提时间

在浸提温度为40℃，稀释20倍，浸提时间分别为20、30、40、50和60min条件下制备红三叶浸提液，测定浸提液蛋白质含量，计算叶蛋白提取率，结果如图1。

图1 不同时间对叶蛋白提取率的影响

结果表明，在浸提温度和稀释倍数一定条件下，浸提率随着浸提时间的延长呈现升高趋势，浸提时间为40min时叶蛋白提取效果最高，达3.29%；浸提时间为20min时，浸提率最低，为2.22%。当浸提时间超过40min，浸提率又有所降低。

2.3 浸提温度

在稀释20倍，浸提温度为30、35、40、45和50℃的条件下将红三叶浸提40min，测定浸提液蛋白质含量，计算浸提率，结果如图2。

图2 不同温度对叶蛋白提取率的影响

结果表明，红三叶浸提率在35℃时最低，为2.49%；在40℃时最高，为3.72%。当温度高于40℃时，叶蛋白提取率逐渐下降。这与蛋白酶活性在不同温度条件下活性强弱有关，适宜温度条件下，活性强，蛋白质分解较多；温度过高使其活性下降，蛋白质分解较少。因而叶蛋白提取率有所降低。

2.4 红三叶叶蛋白3因素正交实验

根据稀释倍数、浸提温度和浸提时间实验结果，在稀释15、20和25倍，浸提30、40和50min，浸提温度35、40和45℃条件下对红三叶进行3因素3水平的正交实验，实验结果见表1。

表1 正交试验结果

表1结果表明，3个因素对红三提取率的影响程度大小依次为：稀释倍数，浸提时间，浸提温度。在40℃，稀释20倍，浸提50min条件下红三叶叶蛋白提取效果最好，提取率为3.59%。

2.5 红三叶叶蛋白絮凝实验

在由正交试验得到的最佳提取条件下，通过测定不同絮凝温度和不同加热时间处理的叶蛋白产量，获得红三叶叶蛋白絮凝最佳的技术参数。

在同一絮凝时间条件下，随着温度升高，蛋白质絮凝效果存在差异。5min时，随着时间的延长，蛋白质絮凝率有降低的趋势，60和70℃处理显著高于80和90℃处理。10min时，70℃处理显著高于其它处理（p＜0.05）。15min时，70℃处理显著高于其它处理（p＜0.05）。

实验结果表明，蛋白质絮凝受虚拟时间和絮凝温度的影响。70℃、10min和15min蛋白质絮凝效果最好，根据环保节能及成本考虑，在蛋白质絮凝环节，选择70℃加热10min为最佳。

3 讨论

牧草叶蛋白生产对牧草生产和畜牧生产均具有重要的生产意义。叶蛋白生产受很多条件的影响，原料、浸提技术和絮凝技术是影响其生产性能的3个重要因素。本试验以适宜调制叶蛋白的优质原料红三叶为研究对象，从稀释倍数，浸提温度，浸提时间3个因素进行了浸提率的比较。在试验结果的基础上，筛选适宜的处理水平，通过3×3正交试验设计，对红三叶叶蛋白的浸提率进行了研究，并在确定浸提工艺的基础上，研究了加热温度和加热时间对叶蛋白絮凝的影响。

结果表明，红三叶叶蛋白浸提率在不同处理下存在差异，其最适浸提条件为：浸提温度为40℃稀释倍数为20，40℃浸提时间50min效果最好，提取率为3.59%。影响红三叶叶蛋白提取的因素大小程度为：稀释倍数>浸提时间>浸提温度。

叶蛋白絮凝试验结果表明，红三叶叶蛋白的最佳絮凝参数为70℃、10min。

在叶蛋白浸提过程中存在着蛋白质溶解及蛋白质降解两个过程。浸提时间过短，蛋白质溶出较少，提取率降低；时间过长，蛋白质溶出虽然较多，但可能存在牧草体内蛋白酶作用增强，加快了蛋白质的降解。因此，适宜的浸提时间比较重要。

浸提温度影响牧草体内蛋白酶的活性高低和蛋白质溶解量的多少。本研究结果也显示出，浸提温度对红三叶的浸提率存在着影响，且影响程度存在差异。

实验结果都表明，稀释倍数是影响叶蛋白生产的最重要因素。稀释倍数过低，蛋白质很容易达到饱和而溶解过少；稀释倍数过高，加大了蛋白质与蛋白酶的结合程度，使蛋白质降解过多，导致效果不好，同时由于稀释过高，增加了叶蛋白的下一步操作。因此，适宜的稀释倍数对于叶蛋白生产来说相当重要。