甘薯块根cDNA 酵母文库的构建及IbNCED3 启动子互作蛋白的筛选鉴定

赵彩良，张洁，唐锐敏，贾小云*

（1.山西农业大学 农学院，山西 晋中 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 晋中 030801）

甘薯是世界上营养丰富的块根作物之一，富含维生素、类胡萝卜素和花青素等对健康有益的抗氧化成分。黄心甘薯和橘心甘薯都富含类胡萝卜素。类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，属于类异戊二烯化合物，其成分主要是反式β-胡萝卜素，能够迅速转化为维生素A，在低等生物、藻类、高等植物乃至动物中都普遍存在［1］，表现出黄色、橙红色或红色。类胡萝卜素在植物中具有多种生物学功能［2-4］。高等植物中类胡萝卜素的氧化裂解主要由类胡萝卜素双加氧酶（CCO）催化，根据作用底物的不同，将CCO分为类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）和9-顺式环氧类胡萝卜素双加 氧 酶（9-Cis Epoxycarote-noid Dioxygenase，NCEDs）［5］2 种类型。

目前类胡萝卜素代谢途径的许多结构基因已从甘薯中分离出来并对其功能做了深入研究。在拟南芥中过表达甘薯IbGGPS基因增加了叶片α-胡萝卜素和叶黄素的含量，并提高了植株对渗透压胁迫的耐受性［6］。从甘薯栽培品种Nongdafu 14的贮藏根中分离获得IbZDS基因的cDNA，在甘薯中过量表达后，大大增加了类胡萝卜素的含量，并提高了植株的耐盐性［7］。IbCHYB的RNAi 转基因植株的贮藏根为橙色，其总胡萝卜素和β-胡萝卜素的含量比对照提高约2.4 倍和16 倍，同时发现与对照相比，IbCHYB的RNAi 转基因甘薯中IbNCED的表达量、ABA 含量和对盐胁迫的耐受性都增加［8］。NCED3能够降解类胡萝卜素，参与植物激素脱落酸（Abscisic Acid，ABA）的生物合成［9］和逆境胁迫响应。玉米中NCED基因的功能缺失导致ABA 含量降低，出现叶片萎蔫的表型［10］。AtNCED3过表达转基因植株中ABA 含量及对水分胁迫的耐受性较野生型均得到提高［11］。拟南芥中过量表达水稻OsNCED3和OsNCED4能增加植株体内ABA 含量，同时提高其抗旱性［12］，而NCED基因敲除的植物在受胁迫时，叶片中ABA 的合成能力减弱［13］。但是关于甘薯块根中IbNCED3在类胡萝卜素代谢及逆境响应中的功能还知之甚少。

cDNA 酵母文库的构建是提取特定组织或细胞的总RNA，然后分离其中的mRNA，通过反转录形成cDNA，将其连接到适当的载体后转化酵母菌株，最终形成包含某个组织特定发育时期或特定处理后全部mRNA 信息的重组DNA 克隆群。目前已广泛通过酵母单杂交（Yeast One-Hybrid，Y1H）和酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）技术筛选cDNA 酵母文库，获得与诱饵蛋白互作的蛋白。酵母单杂交技术是研究DNA 与蛋白质相互作用的方法，具有操作简单、假阳性率低等特点。许奕等［14］构建了干旱胁迫的香蕉cDNA 文库并克隆了MaAQP1启动子，为运用酵母单杂交技术筛选与MaAQP1启动子互作的蛋白，解析其作用机制奠定了基础。黄桂媛等［15］构建了巨峰葡萄的酵母单杂交文库，并筛选了开花相关基因VvFT启动子上游的调控因子，为进一步解析VvFT在调控葡萄开花的分子机制奠定了基础。叶夏琳等［16］通过构建南通小方柿的cDNA 文库，利用酵母单杂交技术初步筛选了3 个与DkGA2ox2启动子互作的蛋白，为探索其上游调控机制提供了理论支持。

本研究通过Gateway 方法构建了甘薯块根cDNA 酵母文库，克隆了IbNCED3的启动子序列，构建了诱饵载体pAbAi-NCED3，并利用酵母单杂交技术筛选甘薯块根cDNA 酵母文库中与IbNCED3启动子互作的蛋白。为后期深入研究IbNCED3在甘薯类胡萝卜素代谢中的功能及表达调控机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料、载体与试剂

甘薯品种：‘徐薯18’（XS-18，白心）、‘徐紫薯3 号’（XZS-3，紫心）由中国农业科学院提供，‘红东’（HD，黄心）由山西农业大学棉花研究所提供，种植于山西农业大学生命科学学院试验田。生长90 d 后，分别挖取3 个甘薯品种的块根，洗净表面泥土，去皮，切成小块，用液氮速冻后存于-80 ℃冰箱。

酵母文库构建所需的载体和试剂分别由山东欧易生物技术有限公司（山东，青岛）和Invitrogen公司所提供。酵母培养所需的酵母氮源基础培养基（Yeast Nitrogen Base，YNB）、金担子素A（Aureobasidin A，AbA）缺 陷 型 培 养 基（Do Supplement/-Ura，SD/-Ura 和 Do Supplement/-Leu，SD/-Leu）购自北京Coolaber 公司。酵母菌株Y187、酵母单杂交菌株Y1HGold（Saccharomyces cerevisiae）、诱饵载体pAbAi 及Prey 载体pGADT7均由山东欧易生物技术有限公司提供。

1.2 总RNA 的提取与mRNA 的分离纯化

将3 个甘薯品种的块根等量混合，液氮研磨，采用Trizol 法提取甘薯块根的RNA，提取的总RNA 按 照Oligotex mRNA Midi Kit 说明 书 进行mRNA 的分离纯化，对得到的RNA 通过琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪NanoDrop 2000C（Thermo Scientifc）检测其完整性和质量。

1.3 cDNA 文库（Uncut 型）的构建

按照CloneMiner 说明书，对符合试验要求的RNA 进行反转录，生成cDNA 第一链、cDNA 第二链，得到双链cDNA。将cDNA 与三框attB1 重组接头连接，3 种接头各连接1 份，得到的3 份连接产物混匀后加入TEN Buffer 清洗过的分级柱，对cDNA 分级分离，进行BP 重组反应，产物转化至大肠杆菌DH10B，加入4 mL SOC 培养基，37 °C 培养1 h 后，得到初级文库菌液。提取初级文库质粒，建立LP 重组反 应，产物转化至DH10B，37 °C 培养12 h，得到次级文库菌液。提取次级文库质粒，转化Y187 酵母感受态细胞，收集转化子，得到酵母工作液。

1.4 文库的质量鉴定

吸取初级文库转化后的菌液，稀释后涂布在含50 μg·mL-1卡那霉素（Kanamycin，Kan）的LB 平板，统计平板上长出的克隆数，按照库容量（cfu·mL-1）=平板上的克隆数/50 μL×100 倍×1×103μL，文库总库容量（cfu）=cfu·mL-1×文库菌液总体积（mL）进行计算。同时，随机挑取单克隆进行PCR 反应，对文库的重组率与插入片段的大小进行鉴定。

吸取次级文库转化后的菌液，稀释后涂布在含50 μg·mL-1氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）LB 平板，按照上述方法进行文库的质量鉴定。

吸取梯度稀释10、100、1000 和10 000 倍的酵母工作液，分别涂布SD/-Leu 平板，统计克隆数，按照库容量（cfu·mL-1）=平板上的克隆数/100 μL×稀释倍数×1×103μL 对文库的库容量进行计算。

1.5 IbNCED3 启动子的克隆与pAbAi-Bait 诱饵载体的构建

IbNCED3启动子序列（基因组序列上游2000 bp）由中国农业科学院甘薯研究所曹清河研究员课题组在‘徐薯18’基因组数据库（未发表）中比对后提取。根据所提取的序列设计IbNCED3启动子 的 扩 增 引 物 （Pro-NCED3-F： CTGCCTATAGTTGGCCGACC；Pro-NCED3-R：GCACAGATTGAGCAGAGCAG）。将扩增产物测序得到的序列通过网站https：//fruitfly. org/seq_tools/promoter. html 预测启动子的核心启动区。

合成Bait 序列，并在序列两端加入酶切位点HindIII 和SalI。 用HindIII 和SalI 双 酶 切pAbAi 质粒，得到纯化的线性化pAbAi 片段后与Bait 序列16 ℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌，通 过100 μg·mL-1的Amp 进 行抗性筛选。提 取阳性单克隆的质粒DNA，用pAbAi 载体序列上的引物（pAbAi-seq：GTTCCTTATATGTAGCTTTCGACAT）测序，同时对质粒进行酶切验证。

1.6 诱饵酵母菌株的获得

利用同源重组的方法，将诱饵载体整合到Y1HGold 菌株中。用BstBI 酶对诱饵质粒pAbAi-Bait 进行单酶切。取1 μg 纯化的线性化DNA 转化至Y1HGold 菌株中，吸取转化产物涂布SD/-Ura平板，30 ℃倒置培养2～3 d，对生长出的克隆进行PCR 鉴 定 （ 检 测 引 物 ： pAbAi-F：GCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTC 和pAbAi-R：CGGCTACATGGCAGTTTGGAG）。选 择阳性克隆进行后续试验。

1.7 抑制诱饵酵母菌株自激活活性的AbA 浓度

吸取500 μL 1.6 中阳性单克隆菌液，用0.9%的NaCl 重悬至OD600=0.002 时，吸取菌液分别涂布 到SD/-Ura/100 ng·mL-1AbA、SD/-Ura/150 ng·mL-1AbA 和SD/-Ura/200 ng·mL-1AbA 的 平板上。根据不同平板上单克隆的生长状况，确定所需AbA 的最适浓度。

1.8 甘薯块根cDNA 酵母文库的筛选

将次级酵母文库质粒，转化到诱饵酵母菌株Y1HGold［pAbAi-Bait］中，酵母菌液稀释10、100、1000 倍后分别涂布于SD/-Leu 平板上，剩余菌液涂布于SD/-Leu/AbA（AbA 添加量为抑制诱饵酵母细胞自激活的浓度）平板。统计SD/-Leu 平板上的单克隆数量，用于文库筛选克隆数的计算（文库筛选克隆数=［cfu·mL-1on SD/-Leu］×［稀释倍数］×［重悬体积（6 mL）］）。待SD/-Leu/AbA平板长出单克隆后在SD/-Leu/AbA 平板上重新再次划线，进行二次筛选。以T7-F：TAATACGACTCACTATAGGGC 和 3'AD-R： GTAGATGGTGCACGATGCACAG 为PCR 检 测 引 物，筛选阳性克隆，送测序。测序序列在NCBI 网站比对，获取该序列的注释信息。

1.9 阳性克隆的酵母单杂交验证

提取1.8 中阳性克隆的酵母质粒DNA，转化DH5α，提取质粒DNA。质粒DNA 转化诱饵酵母的感受态细胞，挑选阳性单克隆，接种于SD/-Leu液体培养基中繁殖培养。用0.9%NaCl 将菌液按1∶10、1∶100、1∶1000 稀释后，分别点滴于SD/-Leu和SD/-Leu/AbA 平板（AbA 添加量为抑制诱饵酵母细胞自激活的浓度），倒置于30 ℃培养3～5 d，观察生长情况。

2 结果与分析

2.1 初级文库的质量鉴定

初级文库转化的菌液稀释100 倍后，在平板上长出约1400 个单克隆，转化平板的库容量（cfu·mL-1）=1400 ∕50 μL×100×1000 μL=2.8×106cfu·mL-1，文 库 的 总 克 隆 数（cfu）=2.6×106cfu·mL-1×4 mL=1.12×107cfu。24 个随机挑选的单克隆都扩增得到了条带，重组率为100%，插入片段大小约在800～2500 bp（图1）。

图1 酵母初级文库的库容量与插入片段大小的鉴定Fig.1 Identification of yeast primary library capacity and inserted fragment size

2.2 次级文库质量鉴定

次级文库的转化菌液稀释100 倍后，在平板上共长出约1800 个单克隆，转化平板的库容量（cfu·mL-1）=1800 ∕50 μL×100×1000 μL=3.6×106cfu·mL-1，文 库的 总 克隆 数（cfu）=3.6×106cfu·mL-1×4 mL=1.44×107cfu。24 个随机挑选的单克隆都扩增得到了条带，重组率为100%，插入片段大小约在600～2000 bp（图2）。

图2 酵母次级文库的库容量与插入片段大小的鉴定Fig.2 Identification of yeast secondary primary library capacity and inserted fragment sizes

2.3 甘薯块根酵母文库质量鉴定

将次级文库cDNA转化酵母菌株Y187。利用血细胞计数仪计算细胞密度：3×107cells·mL-1。对文库滴度进行检测，转化菌液稀释10 000倍后取100 μL涂板，共长出约700 个单克隆，转化平板滴度=700∕100 μL×10 000×1000 μL=7×107cells·mL-1。24个随机挑选的单克隆都扩增得到了条带，重组率为100%，插入片段大小约在600～2000 bp（图3）。

图3 甘薯块根酵母文库质量鉴定Fig.3 Quality identification of sweet potato root tuber yeast library

2.4 IbNCED3 启动子的克隆与核心启动区分析

选取测序获得的序列中起始密码子ATG 上游序列作为启动子序列，命名为IbNCED3-Pro。网站分析发现，IbNCED3-Pro 存在4 个核心启动区域（表1），根据它们的分布位置，选取包括3 和4（-311～-86）区域序列作为诱饵序列。为了降低诱饵序列在酵母单杂交系统中的自激活活性，去除这些序列中连续5 个以上的重复碱基，获得序列（GTTAATCTTTGAAATCGATTTAATAGC CCGAGTTGTTGACTCATCAATTTAAAGT AACTGTGACAGTCTGTTTCGGTGATATA AGTACTGTACGGGGTCAAATAAGTTAAG CAATAGAGTGGCATTTGCACATATCCAA CACGTGTTTATCTCCTACATGTTAGAAG TGGACCTTAAAGCCTTCTCATTATAAAT GGCCTCTCCCCATATCCCTTCTCCCTAC -CACTGTCTCTTC，下划线分别表示核心启动区域3 和4 的序列）。经分析，该序列含有1 个ABA响应元件、1 个光响应元件与1 个低温响应元件。将其构建到酵母单杂交载体pAbAi，命名为pAbAi-NCED3（表2）。

表1 IbNCED3-Pro 的核心启动区域Table 1 Core promoter sequence of IbNCED3-Pro

表2 pAbAi-NCED3 诱饵序列的顺式作用元件Table 2 Cis-element of bait sequence in pAbAi-NCED3

2.5 诱饵质粒的鉴定

将合成的诱饵片段和线性化载体pAbAi 连接，构建重组载体pAbAi-NCED3。根据pAbAi 载体序列，重组载体pAbAi-NCED3 经EcoRI、HindIII 双酶切后应产生4866 bp 的大片段和814 bp 的小片段。如图4 所示，结果与预期相符。

图4 诱饵载体pAbAi-NCED3 的酶切鉴定Fig.4 Identification of pAbAi-NCED3 by enzymatic digestion

2.6 诱饵菌株的转化与鉴定

将构建好的诱饵载体pAbAi-NCED3 用BstBI 单酶切线性化后，转化酵母Y1HGold 菌株。通过PCR 检测诱饵载体是否成功转入Y1HGold 酵母菌株，扩增产物应为515 bp。结果显示（图5），转化后的酵母DNA 中得到了500 bp 左右的目的条带，而阴性对照（水和Y1HGold 菌株）没有扩出条带，表明诱饵载体pAbAi-NCED3 成功转入到Y1HGold 酵母菌株中。

图5 诱饵菌株pAbAi-NCED3 的PCR 鉴定Fig.5 Identification of positive Y1H with pAbAi-NCED3 by PCR

2.7 筛选诱饵菌株的AbA 最佳使用浓度

如图6 所示，诱饵酵母Y1H［pAbAi-NCED3］在添加100 ng·mL-1AbA 的SD/-Ura 培养基 上不能生长。因此，诱饵酵母Y1H［pAbAi-NCED3］的AbA 最佳使用浓度是100 ng·mL-1。

图6 诱饵酵母Y1H［pAbAi-NCED3］在添加不同浓度AbA 平板上的生长情况Fig.6 Growth of bait yeast Y1H［pAbAi-NCED3］on the SD/-Ura plates supplemented with different concentration of AbA

2.8 诱饵载体筛选甘薯块根cDNA 酵母文库

将构建好的甘薯块根cDNA 酵母文库质粒转化诱饵菌株Y1H［pAbAi-NCED3］，统计长出的克隆数。稀释1000 倍后的菌液在SD/-Leu 平板上共长出17 个单克隆，筛选克隆总数=17/100 μL×1000×6 mL=1.02×106＞1.0×l06（表3），表明甘薯块根cDNA 酵母文库的转化效率符合文库筛选要求。

表3 诱饵酵母文库筛选克隆总数统计结果Table 3 Summary of total numbers of clones screened by bait yeasts Y1H［pAbAi-Bait］

文库的初次筛选共获得17 个单克隆，分别在SD/-Leu/100 mg·mL-1AbA 培养基划线，经二次筛选后共获得3 个阳性单克隆（图7）。

图7 酵母文库的二次筛选Fig.7 Second screening of yeast library

2.9 阳性克隆的序列分析

挑选PCR 检测阳性且条带较亮的产物送测序，获得的测序结果在NCBI（https：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）中 比对。Y1H［pAbAi-NCED3］为诱饵筛选到的3 个阳性克隆，其中1 个为DnaJ 蛋白，是广泛存在于植物中的分子伴侣，可以响应各种环境胁迫；1 个为FRIGIDA-Like 蛋白，是春化途径中调控开花的重要蛋白；1 个为功能未知蛋白（表4）。

2.10 酵母单杂交验证

将表4 中列出的以Y1H［pAbAi-NCED3］为诱饵筛选到的3 个阳性克隆（编号1、2、3）进行酵母单杂交验证，结果显示（图8），在SD/-Leu 上，诱饵酵母细胞都能生长，说明AD 质粒已转入诱饵酵母细胞。在添加100 ng·mL-1AbA 的缺陷型培养基SD/-Leu/100 ng·mL-1AbA 上，阳性对照与3 个阳性克隆均能生长，表明3 个阳性克隆均与IbNCED3启动子互作。

图8 IbNCED3 启动子互作蛋白的酵母单杂交验证Fig.8 Validation of proteins interacted with promoter of IbNCED3 by Yeast One-Hybrid

表4 Y1H［pAbAi-NCED3］为诱饵筛选到的序列信息Table 4 Sequence information of clones interacted with Y1H［pAbAi-NCED3］

3 讨论

cDNA 文库质量的高低与库容量和平均插入片段的长度相关，库容量越大，文库所涵盖的信息越完整。当cDNA 文库库容量大于1×106时，才能确保筛选到低丰度的基因［17］。本研究构建的甘薯块根cDNA 酵母文库的库容量达到了1.12×107，高于1×106，重组率为100%，片段插入长度为600～2500 bp，说明该酵母文库质量较高。

在构建好的甘薯块根cDNA 酵母文库中，通过酵母单杂交技术筛选到了3 个与IbNCED3启动子互作的蛋白，测序序列经NCBI 比对显示，与1号克隆相似性最高的序列为未知蛋白；与2 号克隆相似性最高的序列为XM_031256956.1（Ipomoea triloba）-DnaJ 蛋白，一种热激蛋白，响应各种生物和非生物胁迫；与3 号克隆相似性最高的序列为

XM_031247458.1（Ipomoea triloba）-FRIGIDALike（FRL）蛋白，是春化途径中影响开花的一种蛋白。番茄中DnaJ 蛋白（SlDnaJ20）的表达受冷害、NaCl、聚乙二醇和H₂O₂诱导，尤其在热胁迫下大量表达，SlDnaJ20的过量表达增强了转基因番茄的耐热性［18］。OR 蛋白也属于DnaJ 蛋白的一种［19］，研究表明它可以稳定PSY 的活性，促进类胡萝卜素的生物合成并提 高 植 物 的 抗 逆 性［20-21］。Risk［22］等在拟南芥中发现，至少存在7 个同源基因与FRI共同构成FRIGIDA-Like 基因家族。FRIGIDA（FRI）基因和FLOWERING LOCUS C（FLC）基因参与开花调控的春化途径［23］，对开花具有决定性作用。FLC抑制开花，FRI通过促进FLC的表达而推迟植物开花［24］。FRI功能丧失型拟南芥，体内FLC水平降低，植物提前开花［25］，而具有FRI显性基因的拟南芥，则促进FLC的表达，植物晚开花［26］。这表明IbNCED3可能通过 与DnaJ 蛋白和FRIGIDA-Like 蛋白互作参与植物类胡萝卜素代谢、胁迫响应和开花调控。

4 结论

本研究采用Gateway 方法构建了高质量的甘薯块根cDNA 酵母文库，文库的库容量、重组率及插入片段的大小均符合文库筛选条件，可用于通过酵母单杂交和酵母双杂交技术筛选诱饵载体的互作蛋白。利用酵母单杂交技术在甘薯块根cDNA 酵母文库中筛选并验证了3 个与IbNCED3启动子互作的蛋白。