牡丹根腐病拮抗菌MRX2-1 的鉴定及发酵条件优化

毛咪，吕长平，帅佳琪，石杨，江莉娜，康敏

（1.湖南农业大学 园艺学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学 风景园林与艺术设计学院，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学湖南省中亚热带优质花木繁育与利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

牡丹根腐病是一种主要由茄病镰刀菌（Fusarium. solani）引起的土传真菌病害［1］，牡丹根腐病又称烂根病，主要危害牡丹根部，且在国内发生十分普遍［2］。目前，牡丹根腐病的防治主要以农业防治为基础，以化学防治为关键，甲基托布津，多菌灵等都是常用的化学农药［3］，但长期施用化学药剂易污染环境并易使病菌产生抗药性，有研究报道经亚致死剂量汰选试验测定，茄病镰刀菌极易对多菌灵产生抗性［4］。

在新农业发展时代背景下，由拮抗菌制成的生物制剂因无副作用、环境相容性高、不产生农药残留等优点，越来越受到人们的关注［5］。在茄病镰刀菌的生物防治方面，已经报道的拮抗细菌主要为芽孢杆菌属（Bacillus）细菌、土壤杆菌属（Agrobacterium）细菌和假单胞菌属（Pseudomonas）细菌［6］，其中应用最多的是芽孢杆菌属细菌，芽孢杆菌具有较强的抗逆性和易保存性［7］，因此在对牡丹根腐病的防治中有着较大的发展潜力和利用前景。响应面分析法在单因素试验基础上，能最大条件的优化试验次数［8］，反应出不同因素间对试验结果的交互影响［9］。目前，响应面法优化是菌株发酵条件中常用的方法，但利用响应面法优化牡丹根腐病拮抗菌发酵条件的研究尚未见报道。

本研究通过从湖南农业大学花卉基地的健康牡丹根茎部分离获得1 株对茄病镰刀菌有明显拮抗作用的菌株MRX2-1，对其进行形态学观察，生理生化指标测定及16S rDNA 序列分析初步将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌，采用单因素试验并结合响应面法分析优化菌株MRX2-1 的发酵条件，依据单因素试验结果，选取对发酵条件影响较大的温度、接种量和pH 值3 个因素，以OD600作响应值，采用Box-Behnken 中心组合设计进行三因素三水平的组合试验，获得菌株MRX2-1 的最佳发酵参数，旨在为后续牡丹根腐病生防菌剂的研发与应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

菌株MRX2-1 由本课题组前期从湖南农业大学花卉实践教学基地的健康牡丹根茎部分离获得，现保存于湖南农业大学。靶菌为牡丹根腐病致病菌茄病镰刀菌，由患病牡丹根部分离获得。

1.1.2 供试菌株培养基

PDA 培养基（g·L-1）：马铃薯粉6.0，葡萄糖20.0，琼脂粉20.0，pH 值5.6±0.2；NB 固体培养基（g·L-1）：蛋白胨10.0，牛肉浸粉3.0，NaCl 5.0，琼 脂 粉15.0，pH 值7.2±0.2；LB 液 体 培 养 基（g·L-1）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 值7.0±0.1。上述培养基灭菌条件均为121 ℃高压灭菌15 min。

1.1.3 主要试剂和仪器

TSINGKE 植物DNA 提取试剂盒，北京擎科生物科技有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海仪天科学仪器有限公司；恒温振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计，上海翱艺仪器有限公司；恒温培养箱，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.2 拮抗菌抑菌效果测定

采用平板对峙法［10］，以提前7 d 于PDA 平板上活化的茄病镰刀菌为靶菌。用灭菌后的打孔器（5 mm）在距PDA 平板中心两侧3 cm 处各打一孔，用镊子取靶菌菌饼接种于平板一侧，制备对数生长期的拮抗菌MRX2-1 菌液［11］，用移液枪吸取20 μL 菌液接种于另一侧孔中。每个处理设置3 组重复，以单独接种茄病镰刀菌作为对照组，于恒温培养箱中28 ℃恒温培养7 d，计算抑菌率。

1.3 拮抗菌MRX2-1 的鉴定

1.3.1 形态特征及生理生化特征

根据参考文献［12-13］对菌株MRX2-1 的形态结构及生理生化特性进行检测。

1.3.2 分子生物学鉴定

利用试剂盒提取细菌基因组DNA，用细菌通用 引 物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′） 和 1492R （5′-GGTTACCTTGTTAGACTT-3′）进行PCR 的扩增［14］。将扩增好的PCR 产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，将测序所得序列在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，利用MEGA6.0 软件分析序列，用N-J 法构建发育进化树［15］。

1.4 拮抗菌MRX2-1 发酵条件优化

1.4.1 拮抗菌MRX2-1 生长曲线测定

将MRX2-1 种子液以1%的接种量接种于LB液体培养基中，以不接种子液设为对照组，设置3组平行 试验，置于28 ℃、180 r·min-1摇 床震荡培养，采用紫外分光光度法每隔4 h 取样测OD600值，共测13 个点，绘制生长曲线。

1.4.2 单因素试验筛选最佳发酵条件

比较不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、pH（5、6、7、8、9）、转 速（120、140、160、180、200 r·min-1）、温度（28、30、32、34、36 ℃）4 个因素对拮抗菌MRX2-1 生长的影响，以OD600为指标，获得最佳单因素发酵条件。

1.4.3 正交试验确定最佳组合

在单因素试验的基础上，选取接种量、pH、温度3 个因素为自变量，以OD600为响应值，进行三因素三水平的组合设计（表1）。采用Box-Behnken中心组合试验设计对发酵条件的参数进行响应面优化［16］，以获得最佳的发酵组合。

表1 Box-Behnken 响应曲面设计试验因素水平和编码Table 1 Response surface experimental design test factor levels and code of Box-Behnken

1.5 数据分析处理

采用SPSS 26.0 和Excel 2016 软件对试验数据进行处理并进行分析；采用Design-Expert 12 进行响应面结果分析；利用OriginPro8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌MRX2-1 抑菌结果

拮抗菌MRX2-1 的平板对峙试验结果如图1所示，MRX2-1 菌株对茄病镰刀菌的抑菌效果显著且稳定，试验组抑制率可达52.78%±0.43%。表明菌株MRX2-1 对茄病镰刀菌具有较好的拮抗作用，可作为1 株生防菌进行后续的发酵条件优化。

图1 拮抗菌MRX2-1 对茄病镰刀菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of antagonistic bacterium MRX2-1 on Fusarium solanacearum

2.2 拮抗菌MRX2-1 鉴定结果

2.2.1 形态特征及生理生化特征

菌株MRX2-1 在NB 固体培养基上于28 °C 培养2 d 后，菌落呈圆形、白色、菌体表面湿、边缘不整齐且突起有褶皱、不透明，菌体呈杆状（图2A、2B），革兰氏染色结果菌体呈现紫色，为革兰氏阳性菌（图2C）。

图2 拮抗菌MRX2-1 的形态特征及革兰氏染色结果Fig.2 Colony morphology of strain MRX2-1 and the result of Gram staining

菌株MRX2-1 的生理生化指标：甲基红、淀粉水解、V-P 试验、明胶液化等反应均呈阳性，吲哚试验检测呈阴性，在15%NaCl 条件下可以生长，可利用葡萄糖、蔗糖等碳源。

2.2.2 分子鉴定结果

提取MRX2-1 基因组DNA 进行PCR 扩增，PCR 产物的基因序列经测序长度为1380 bp，将基因序列在GenBank 数据库中与已知菌株基因序列进行BLAST 比对，通过MEGA 构建系统发育树（图3）。结果表明，菌株MRX2-1 与Bacillus amyloliquefaciens（HM107808.1）聚于同一分枝，且相似度高达99%以上。结合形态学和分子生物学鉴定结果，将生防菌株MRX2-1 鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

图3 基于16S rDNA 序列构建的菌株MRX2-1 系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain MRX2-1 constructed based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株MRX2-1 发酵条件优化结果

2.3.1 生长曲线的测定

菌株MRX2-1 的生长曲线如图4 所示，对照组几乎处于稳定状态，没有较大起伏，菌株MRX2-1在接种的0～16 h 生长速度较快，16～32 h 生长速度降低，在32 h 到达生长稳定期，故将32 h 作为菌株MRX2-1 的最佳生长周期。

图4 菌株MRX2-1 生长曲线Fig.4 Growth curve of strain MRX2-1

2.3.2 单因素试验结果

各单因素发酵条件对菌株MRX2-1 生长量的影响如图5 所示。pH 对菌株生长影响较大，pH 在5～9 时，菌株活菌数呈先增加后降低的趋势，当pH 在5～6 时，细菌处在酸性生长环境下，菌株可以正常生长且OD600值在增加，说明菌株具有较强耐酸性，pH 为7 时，活 菌数达 到峰值，pH 继 续增大，菌株活性逐渐降低但部分菌株仍可生长，说明菌株具有一定的耐碱能力。当pH 为7 时，OD600值达到最大，故选7 作为最佳发酵pH，同时，选择pH 5、6、7 进行响应面优化试验。接种量在1%～5%范围内，OD600值呈现先增大后减小的趋势。接种量为2%时，菌株活菌数达到最大，即峰值。故将2%作为最佳发酵接种量，并选择接种量1%、2%、3%进行响应面优化试验。温度对菌株生长影响显著，OD600值随温度的增大而增大，温度达到34 ℃时，OD600值达到峰值，温度继续上升，OD600值开始下降，但仍高于最初值（温度为28 ℃时），说明菌株在一定程度上能耐高温。当温度为34 ℃时，OD600值达到峰值，故选择34 ℃作为最佳发酵温度，并选择温度32、34、36 ℃进行响应面优化试验。转速对菌株生长影响较大，随着转速的增加，OD600值逐渐增大，活菌数也逐渐增多，这是因为随着转数的增加，使菌株与液体培养基中的营养物质接触更加充分，菌株生长中所需的氧气含量也增高，满足了菌株生长中的代谢需求，故培养基中的菌株活菌量也随之增加，且在该试验中转速为200 r·min-1时，OD600值达到最大，故将200 r·min-1作为试验的最佳发酵转速。

图5 不同发酵条件对菌株MRX2-1 生长的影响Fig.5 Effects of different fermentation conditions on the growth of strain MRX2-1

2.3.3 响应面法优化发酵条件

根据单因素试验的结果，以接种量（A）、温度（B）、pH（C）为自变量，OD600为响应值，采用Box-Behnken 中心组合试验进行设计对发酵条件的参数进行响应面优化（表2）。

利用Design Expert12 软件对表2 中的结果进行拟合，得到回归方程：Y=1.92+0.088 4A-0.010 0B-0.023 9C-0.001 7AB+0.018 0AC+0.019 7BC-0.163 5A²-0.043 8B²-0.115 0C²。对模型进行方差分析（表3）。

表2 响应面设计方案和结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

由表3 可见，所建模型的P值＜0.000 1，模型呈显著差异；失拟项P值=0.235 9＞0.05，说明失拟项不显著，模型不失拟，选择合理。方程决定系数R2=0.996 1，说明该模型能解释99.61%的响应值变化，校正决定系数R2Adj=0.991 1，说明该模型与试验拟合较好；误差较小。综合试验回归方程方差分析结果，表明该响应面优化模型具有可行性。同时，模型一次项的A、C 及二次项的A2、B2、C2对结果影响均为极显著（P＜0.01）；交叉项AC、BC 对结果影响显著（P＜0.05）。响应面模型极显著地反映出了OD600值与接种量、温度、pH 三个因素之间的关系。由表3 的F 值大小判断，3 个因素对OD600值影响程度大小依次为：接种量＞pH值＞温度。

表3 响应面试验回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation of response surface experiment

响应面是指响应值对试验中的各因子所形成的三维空间的曲面图［17］，响应面可以直接反映出试验中接种量、pH、温度交互作用对OD600值的影响，响应面图形坡度越陡，则交互作用越明显，坡度越缓，则交互作用越弱［18］，试验中各因素交互作用对OD600值影响的响应曲面见图6。

由图6 可见，3 个响应面均为曲面，且开口均向下，各响应面上存在最高点，表明3 个响应面的响应值均存在极高值。3 组响应面中的等高线均为椭圆形，说明各因素间存在交互作用。接种量和pH 的交互作用最强，温度和pH 交互作用最弱。利用Design Expert12 软件对回归模型进行分析，确定最佳发酵条件为接种量1.99%、pH=6.97、温度34.41 ℃，在此条件下，预测OD600的值为1.929。考虑到试验可行性和实操性，将最佳发酵参数修改为接种量2%、pH=7、温度34 ℃。在此最优条件下，OD600值为1.879，与模型预测值（1.929）相差较小，验证了模型的可靠性，说明响应面法对发酵条件的优化具有可行性。

图6 各因素交互作用对菌株MRX2-1 发酵中OD 值影响的响应面Fig.6 Response surface analysis of the effect of the interaction of various factors on the OD value in the fermentation of strain MRX2-1

3 讨论

研究表明芽孢杆菌属细菌具有提高植物耐盐性和抗氧化酶活性的能力［19］，提高植物自身的抗病性。针对牡丹根腐病，吴玉柱等［20］用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis制剂、巨大芽孢杆菌B. megaterium制剂和枯草芽孢杆菌B. subtilis制剂进行牡丹根腐病进行田间药效试验，结果表明3 种生防菌剂对牡丹根腐病防治效果良好，防治效果均达70%以上。孟国庆等［21］通过平板对峙试验获得了两株对牡丹根腐病据有拮抗作用的细菌菌株，结合形态学和分子生物学鉴定，确定2 株细菌均为芽孢杆菌属（Bacillus）细菌。

本研究中分离出对牡丹根腐病最具拮抗作用的菌株MRX2-1，其同源性比对与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）最为接近。解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的亲缘关系最高，并在生长过程中可以产生许多代谢产物［22］，使其产生较强的抑菌能力，能有效抵御各种细菌和真菌对植物造成的威胁。刘东等［23］通过平板对峙试验证明解淀粉芽孢杆菌可以有效抑制大豆疫霉菌丝的生长及孢子囊的形成；蒋凯丽等［24］经研究表明，解淀粉芽孢杆菌对链格孢菌、拟康宁木霉和胶孢炭疽菌等多种番茄病原菌均有较好抑制效果，且抑制率均高达65%以上。张木清等［25］从甘蔗健康叶片中分离获得了1 株解淀粉芽孢杆菌，并对其进行研究，发现其产生的脂肽类抗菌物质对甘蔗鞭黑穗病病原菌抑制效果显著。

通过优化生防菌培养条件可以提高菌体的有效活菌数和抑菌物质产量［26-27］。通过发酵条件优化能更好地挖掘并且展现出拮抗菌株的拮抗作用，一方面提高菌株活菌量，另一方面能使菌株产生更多抑菌代谢产物，从而提高防效［28］。正交试验是研究多因素多水平的一种设计方法，通过正交试验，可以有效减少试验次数，选择一部分有代表性水平组合进行试验，体现出各因素之间的交互作用。解淀粉芽孢杆菌MRX2-1 液体发酵条件的优化涉及多个因素和水平，若是采用传统的试验方法，则工作量加重且不易得到清晰的试验结果。采用Box-Behnken 响应面分析法可以有效的筛选出影响菌株MRX2-1 发酵条件的主要因素，从而达到优化的目的。

4 结论

本研究以菌株MRX2-1 的生长量为考量指标，通过Box-Behnken 设计并结合响应面分析优化菌株发酵条件。结果表明最佳发酵条件为：发酵温度34 ℃，初始pH 7，接种量2%。在此条件下，OD600值可达1.879，实际OD600值与预测OD600值相比，其相对误差仅为2.59%，验证了响应面法对发酵条件优化的可行性。优化后的发酵条件提高了菌株MRX2-1 的有效活菌数，节约了发酵成本。为后期菌株MRX2-1 作为微生物菌剂用于牡丹根腐病的田间防治提供一定的参考。