尿蛋白/肌酐比值、碱性磷酸酶及微小核糖核酸92a与2型糖尿病合并骨量减少的相关性

邓琼琼，赵瑞

(河南科技大学第一附属医院 内分泌科，河南 洛阳 471000)

糖尿病是一组以血糖升高为主要表现的慢性代谢性疾病，其中以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占比最大，达90%以上。T2DM持续进展可导致多种代谢异常，不仅有糖、蛋白质、脂肪代谢紊乱，还包括钙代谢负平衡和骨代谢异常。相关研究报道，糖尿病患者中有20%～60%的患者并发骨质疏松，属于骨折高风险人群[1]。糖尿病性骨质疏松症已逐渐成为影响患者生存质量的重要原因之一，其较高的致残率已引起人们的重视。糖尿病性骨质疏松症早期无特异性表现，较难发现，常因骨折就诊而被明确诊断。因此，找到有效的生物学指标对T2DM患者开展骨质疏松筛查和骨折的风险评估，并及时对高风险的患者进行干预治疗，对于降低糖尿病性骨折风险有重要意义。尿蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ratio，UACR)是用于监测尿蛋白排出情况的一种可靠方法，有研究发现，在UACR≥30的T2DM患者中骨质疏松症的发生风险显著增加，因此认为UACR水平与T2DM患者骨质疏松症的发生存在一定关系[2]，但类似研究较少。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是一组具有特异性的磷酸酯酶，在人肝、骨、肾、小肠、乳腺等组织中有较高的分布。研究表明，ALP与成骨细胞的早期分化密切相关，在成骨细胞分化早期ALP处于较高水平[3]。有研究指出，微小核糖核酸92a(microribonucleic acid 92a，miRNA-92a)在骨生成和吸收中扮演了重要角色，在T2DM并发骨质疏松患者中存在明显异常表达[4]。本研究在既往研究的基础上，同时探讨UACR、ALP及miRNA-92a与T2DM合并骨量减少的相关性，为临床T2DM患者骨量下降风险的早期评估和筛查提供方法和更丰富的理论依据。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象选择2019年10月至2020年12月在河南科技大学第一附属医院就诊的92例T2DM患者，依据双能X线骨密度检测仪测定结果将患者分为骨量正常组(n=37)和骨量减少组(n=55)。纳入标准：(1)参照《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[5]及《中国人骨质疏松症诊断标准专家共识(2014)版》[6]的相关诊断标准，经本院诊断为T2DM合并骨量减少；(2)接受双能X线骨密度检测确诊。排除标准：(1)合并其他影响骨代谢的疾病如恶性肿瘤、血液系统疾病、类风湿关节炎、甲状腺及甲状旁腺功能异常、卵巢功能异常或切除等；(2)既往有骨折病史(包括创伤性和病理性骨折)；(3)2 a内或目前正在使用对骨代谢有影响的药物；(4)有肢体运动障碍致使长期卧床。

1.2 检测方法

1.2.1骨密度测定 采用徐州品源电子科技有限公司的双能X线骨密度仪(型号Dexa Pro-I)对患者髋部和腰椎进行骨密度测量，以2个部位最低T值计。T>-1.0 SD为骨量正常，T≤-1.0 SD为骨量减少。根据骨量减少的程度，将-1.0 SD≥T>-1.5 SD划分为轻度骨量下降，-2.5 SD≤T≤-1.5 SD划分为中度骨量下降，T<-2.5 SD划分为重度骨量下降。

1.2.2UACR测定 患者于入院第2天晨留取清洁中段尿10 mL，并送至检验科进行离心处理(5 000 r·min-1，离心8 min)，留取上层清液备检，采用比浊法测定尿蛋白，采用比色法测定尿肌酐，试剂盒均由科艾博生物科技有限公司提供，根据尿蛋白和尿肌酐值测算UACR值。

1.2.3血清ALP、miRNA-92a测定 采集患者入院第2天晨空腹静脉血10 mL，并送至检验科进行离心处理。(1)分离5 mL静脉血以3 000 r·min-1离心10 min，得到血清并采用免疫比浊法检测ALP水平，试剂盒由科艾博生物科技有限公司提供。(2)分离5 mL静脉血在常温以15 000 r·min-1离心5 min，收集上层血清后在4 ℃环境下进行第2次离心处理，以12 000 r·min-1离心6 min，取得血清置于-80 ℃环境中保存备检。先对血清样本中总RNA进行提取(提取试剂为TRIzol)，在总RNA中取5 μL RNA进行凝胶电泳(凝胶材料为琼脂糖)纯化，然后实施逆转录操作后得到cDNA(逆转录试剂盒提供者为德国ThermoFisher公司提供，并严格按期说明书步骤进行)，内参为β-actin。对cDNA进行实时荧光定量PCR，反应条件为94 ℃预变性10 min，94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共循环35次，引物序列由德国ThermoFisher公司合成，计算miRNA-92a的相对表达量(计算方法为2-ΔΔCt)。

2 结果

2.1 临床基础资料两组患者临床基础资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者临床基础资料比较

2.2 UACR、ALP及miRNA-92a水平骨量减少T2DM组患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于骨量正常T2DM组(P<0.05)。见表2。

表2 骨量减少T2DM组与骨量正常T2DM组患者UACR、ALP及miRNA-92a水平比较

2.3 不同程度骨量减少T2MD患者UACR、ALP及miRNA-92a水平重度骨量下降组患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于中度骨量下降组和轻度骨量下降组，中度骨量下降组患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于轻度骨量下降组(P<0.05)。见表3。

表3 不同程度骨量减少T2MD患者UACR、ALP及miRNA-92a水平比较

2.4 UACR、ALP及miRNA-92a与T2DM患者骨量减少相关性分析Pearson相关性分析结果显示，UACR、ALP及miRNA-92a与T2DM患者骨量减少程度呈正相关(r=0.652，P<0.001；r=0.596，P<0.001；r=0.369，P<0.001)。见图1。

图1 UACR、ALP及miRNA-92a相关性分析

3 讨论

骨代谢异常是糖尿病较常见的并发症，是导致糖尿病患者骨质疏松和骨折风险增大的主要因素。随着我国生活水平的提升，T2DM呈明显上升趋势，T2DM合并骨质疏松病例数明显增多。相关调查显示，T2DM患者骨质疏松的综合发病率高达37.8%，并且随着年龄的增长而增加(60岁以上40.1%，60岁以下26.5%)[7]。及早发现和控制T2DM患者骨代谢问题，在减少T2DM患者骨折风险和改善患者生存质量中具有重要意义。迄今，学者们公认1型糖尿病患者容易发生骨量减少，但T2DM患者骨密度增高、正常和降低3种情况均有报道，但骨折发生率增高已被证实[8]。T2DM患者骨密度存在争议可能与样本量和研究对象存在个体差异等因素有关。本研究纳入的92例T2DM患者中55例患者存在骨量减少，37例T2DM患者骨量正常。本研究结果显示，骨量减少T2DM组患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于骨量正常T2DM组，提示UACR、ALP及miRNA-92a可能与T2DM患者骨量存在一定关系。

UACR是临床用于监测尿蛋白排出情况的一种可靠方法，可一定程度反映T2DM患者肾功能。有研究发现，UACR≥30 mg·g-1的糖尿病患者其骨质疏松发生率高于UACR<30 mg·g-1的糖尿病患者[9]。本研究结果显示，骨量减少T2DM组患者UACR水平高于骨量正常T2DM组，与上述结果相符。原因可能为：(1)大量蛋白从尿液丢失，尿钙、磷排出增多，骨质下降；(2)T2DM患者出现大量蛋白尿，肾功能严重损害，机体1α-羟化酶活性低导致维生素D合成减少，进一步引发成骨细胞数量及活性下降；(3)T2DM患者肾功能损害，钙、磷代谢稳态被打破，甲状旁腺增生，糖尿病肾病患者存在继发性甲状旁腺功能亢进，甲状旁腺素分泌增多，使得骨吸收增加，加重骨量丢失。T2DM患者合并骨量减少使得病情更加复杂，本研究还发现UACR水平与患者骨量减少程度呈正相关，T2DM患者可在医生指导下定期做UACR检查，及时发现骨代谢异常，避免向骨性疾病发展。

ALP是一组能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团的同工酶。大量研究已证实，ALP是骨质代谢的重要参与者，其与骨形成及骨矿化有着密切联系，目前已被公认为是评价骨质形成和转换重要生化指标之一[10-11]。研究表明，成骨细胞表面存在胰岛素受体，胰岛素对成骨细胞的生理功能发挥一定的调节作用，T2DM患者存在体内胰岛素相对缺乏，影响成骨细胞的功能和活性[12]。成骨细胞是ALP的主要来源，成骨作用及成骨细胞数量及活性对机体ALP的水平有着重要影响。本研究结果显示，骨量减少T2DM组患者ALP水平高于骨量正常T2DM组，且与患者骨量减少程度呈正相关，提示ALP与T2DM患者骨量减少存在相关性。ALP在组织分布广泛，除了骨性组织之外，在肝、肠、肾等组织也有较高分布，机体血清ALP水平还受其他组织影响，其灵敏度和特异性不具有优势。因此，ALP可以粗浅地反映T2DM患者骨代谢水平。

miRNA有17～25个核苷酸，对基因的表达起重要调控作用。研究表明，miRNA参与调节细胞增殖、分化及凋亡，与多种骨性疾病如骨质疏松、软骨细胞及基质代谢异常的发生发展有着密切联系[13]。随着研究的深入，更多研究发现了与成骨分化正向和负向调控相关的miRNA，研究认为miRNA通过骨形态发生蛋白、Wnt信号通路、β-catenin等影响成骨细胞增殖分化过程及骨基质的生成、矿化，从而影响骨量[14-15]。目前临床上已发现的与骨代谢异常相关的miRNA如miR-26a、miR-27、miR-29a、miR-218等，但对miRNA-92a的相关研究缺乏，参考的依据较少。本研究结果显示，骨量减少T2DM组患者miRNA-92a水平高于骨量正常T2DM组，且与患者骨量减少程度呈正相关，表明miRNA-92a表达异常与T2DM患者骨量减少存在相关性。临床对于已知且有特异性的与骨代谢相关的miRNA还需进一步深入研究，为临床诊治骨代谢性疾病开辟更好的途径。

综上所述，UACR、ALP及miRNA-92a水平与T2DM患者骨量减少存在相关性，T2DM患者UACR、ALP及miRNA-92a水平升高，其骨量减少风险增加，临床根据医院及患者实际情况，可将上述指标作为T2DM患者骨量减少的辅助参考指标。