金樱子配方颗粒质量控制研究

李 蕊 张志强 高 扬

(北京康仁堂药业有限公司，中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京 101301)

金樱子为蔷薇科植物金樱子RosalaevigataMichx.的干燥成熟果实。10～11月果实成熟变红时采收，干燥，除去毛刺。味酸、甘、涩，性平，具有固精缩尿、固崩止带、涩肠止泻的功效，用于治疗遗精滑精、遗尿尿频、崩漏带下、久泻久痢[1]。研究表明金樱子具有抗氧化、抗肿瘤、降糖降脂、免疫调节、保护肾脏等多种药理作用[2，3]。金樱子中的化学成分有酚酸类、黄酮类、三萜类、多糖类等[4-6]。中药配方颗粒是在中医药理论指导下，采用现代科技手段将传统中药饮片按一定的生产工艺制成的提取物与适当辅料或药材细粉混合后制成的粉状或颗粒状产品，解决了传统中药饮片难以携带、煎煮麻烦等问题，更加适应现代快节奏的生活方式[7]。金樱子配方颗粒是以金樱子中药饮片为原料，经过水煎煮、过滤、浓缩、干燥、制剂等工艺制成。目前，关于金樱子配方颗粒质量标准的研究较少，现以本企业的配方颗粒为原料，对其质量标准进行研究，以期为金樱子配方颗粒的质量控制提供依据。

1 材料

仪器：Waters ACQUITY UPLC©H-Class超高效液相色谱仪(PDA Detector检测器，Empower 3色谱工作站)，ME104E电子天平(梅特勒·托利多)，JY20002电子天平(梅特勒·托利多)，BSA124S电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司)，BT25S电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司)。CAMAG薄层成像系统，DZKW-4恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，KQ-500DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，硅胶G板(Merck KGaA，银龙预制板，烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂)。

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC©HSS T3(2.1×100 mm，1.8 μm)。

试药：金樱子配方颗粒K-01、K-02、K-03、K-04、K-05、K-06、K-07、K-08、K-09、K-10、K-11、K-12、K-13、K-14、K-15、K-16、K-17、K-18。

儿茶素对照品(批号：110877-201604，99.2%，中国食品药品检定研究院)，没食子酸对照品(批号：10831-201605，90.8%，中国食品药品检定研究院)，原儿茶酸对照品(批号：110809-201205，99.9%，中国食品药品检定研究院)，鞣花酸对照品(批号：111959-201903，88.8%，中国食品药品检定研究院)，金樱子对照药材(批号：121047-201204，中国食品药品检定研究院)。

试剂：乙腈(色谱纯，Merk)、磷酸(色谱纯，Fisher Chemical)；蒸馏水(屈臣氏)；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 溶液的制备

取金樱子配方颗粒适量，研细，取1 g，加水20 mL 使溶解，用乙酸乙酯振摇提取两次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取金樱子对照药材1 g，加水50 mL，煮沸30 min，过滤，滤液蒸干，加水20 mL使溶解，同法制成对照药材溶液。

2.1.2 薄层色谱实验

照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取“2.1.1”项制备的供试品溶液5 μl、对照药材溶液4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5∶5∶1∶0.1)为展开剂，展开、取出、晾干、喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热数分钟，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，见图1。

2.2 浸出物、粒度、水分、溶化性测定

浸出物：按照2015年版《中国药典》中醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定样品浸出物的含量，采用乙醇作溶剂。计算得18批金樱子配方颗粒中浸出物的平均值为44.1%，RSD=4.57%。

粒度：按照2015年版《中国药典》通则0982中的第二法(双筛分法)测定样品的粒度。测得18批次金樱子配方颗粒不能通过1号筛与能通过5号筛的百分率平均值为6.4%，符合《中国药典》中颗粒剂项下规定粒度不超过15%的要求。

1-金樱子配方颗粒(K-01)、2-金樱子配方颗粒(K-02)、3-金樱子配方颗粒(K-03)、4-金樱子配方颗粒(K-04)、5-金樱子配方颗粒(K-05)、6-金樱子配方颗粒(K-06)、7-金樱子配方颗粒(K-07)、8-金樱子配方颗粒(K-08)、9-金樱子配方颗粒(K-09)、10-金樱子配方颗粒(K-10)、11-金樱子配方颗粒(K-11)、12-金樱子配方颗粒(K-12)、13-金樱子配方颗粒(K-13)、14-金樱子配方颗粒(K-14)、15-金樱子配方颗粒(K-15)、16-金樱子配方颗粒(K-16)、17-金樱子配方颗粒(K-17)、18-金樱子配方颗粒(K-18)、DY-金樱子对照药材121047-20104

水分：按照2015年版《中国药典》通则0832中的第二法(水分测定)进行检查，计算得18批次金樱子配方颗粒中的平均水分为6.5%，RSD=3.9%，符合《中国药典》中颗粒剂项下不超过8%的要求。

溶化性：取18批金樱子配方颗粒，每批10 g,加热水200 mL，搅拌5 min，观察到颗粒全部溶化，说明该颗粒的溶化性符合要求。

2.3 含量测定方法的建立

2.3.1 色谱条件与专属性试验

选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100 mm，内径为2.1 mm，粒径为1.8 μm)的色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3 mL，柱温为30 ℃，检测波长为220 nm，进样量：1 μl，理论板数按儿茶素峰计算应不低于7 500，色谱图见图2。

表1 梯度洗脱表

图2 阴性对照(A)、对照品(B)和供试品(C)溶液测定的专属性试验色谱图

2.3.2 对照品溶液的制备

取儿茶素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL 含35 μg儿茶素的溶液，即得对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取金樱子配方颗粒，研细，取约0.25 g，精密称定，精密加水25 mL，使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

2.3.4 方法学考察

精密度试验：取35.44 μg/mL儿茶素对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算得峰面积的RSD=2.3%，表明仪器的精密度良好。

重复性试验：取同一批样品(批号：200424-331100-17)，按“2.3.3”项方法制备6份供试品溶液，分别进行测定，计算得儿茶素含量的平均值为1.10 mg/g，RSD=2.5%，表明该方法的重复性良好。

稳定性试验：取同一批样品(批号：200424-331100-17)，按“2.3.3”项方法制备1份供试品溶液，“2.3.1”项色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进行测定，记录峰面积，计算得峰面积的RSD=1.1%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性较好。

线性试验：取儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.207 28 mg儿茶素的溶液，作为儿茶素对照品母液；分别精密吸取对照品母液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，过滤，精密吸取上述溶液各1 μL，注入高效液相色谱仪(UPLC)，按“2.3.1”所述方法测定儿茶素色谱峰峰面积，以儿茶素色谱峰的峰面积为纵坐标，儿茶素的浓度为横坐标，最终求得回归方程为y=11 699 294.382 0x+2 993.583 0，R2=0.999 6，其线性范围为0.020 7～0.207 3 mg/mL-1。该范围内儿茶素线性关系良好。

加样回收试验：精密称取儿茶素对照品1.383 mg、2.765 mg、3.947 mg，分别置于500 mL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，作为对照品溶液。取已知含量的样品粉末，精密称取9份，每份0.1 g，分别按照0.5∶1、1∶1、1.5∶1的量加入对照品，即分别加入25 mL对照品溶液，精密称取金樱子配方颗粒约0.125 g,其余按“2.3.3”项方法制备供试品溶液，分别进行测定，计算回收率及RSD。金樱子配方颗粒中儿茶素的回收率均值为100.22%，RSD=2.6%，表明方法的回收率良好，检测结果准确可靠，见表2。

表2 加样回收实验的结果表

2.3.5 样品测定

取18批金樱子配方颗粒，按“2.3.3”项方法制备供试品溶液，并按“2.3.1”项色谱条件分别进样检测，计算每次样品中儿茶素的含量。18批样品中儿茶素的含量分别为：2.67 mg/g、1.83 mg/g、2.09 mg/g、2.40 mg/g、0.85 mg/g、2.05 mg/g、2.10 mg/g、1.85 mg/g、2.30 mg/g、2.13 mg/g、1.09 mg/g、1.04 mg/g、0.69 mg/g、0.72 mg/g、0.80 mg/g、0.74 mg/g、1.24 mg/g、0.67 mg/g，平均值为1.51 mg/g。

2.4 特征图谱的建立

2.4.1 色谱条件与系统适用性

按“2.3.1”项色谱条件进行。

2.4.2 参照物溶液的制备

取儿茶素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL 含35 μg儿茶素的溶液，另取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL含2.5 μg没食子酸的溶液，另取原儿茶酸、鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成1 mL含4 μg目标对照品的溶液，作为对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备

按“2.3.3”项方法制备18批金樱子配方颗粒供试品溶液。

2.4.4 共有峰的标定及特征峰的指认

按“2.3.1”项色谱条件，分别取“2.4.2”的对照品溶液及“2.4.3”的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，进行测定，得到18批金樱子配方颗粒的UPLC图谱，18批样品共确认共有峰5个，其中1号峰为没食子酸，2号峰为原儿茶酸，4号峰为儿茶素，5号峰为鞣花酸，其中4号峰儿茶素峰保留时间适中，峰面积较大，分离度较好，确定为S峰(见图3)。

(A) 没食子酸对照品；(B) 原儿茶酸对照品；(C) 儿茶素对照品；(D) 鞣花酸对照品；(E) 金樱子配方颗粒

2.4.5 指纹图谱的建立

采用药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对18批金樱子配方颗粒的UPLC图谱进行处理，并生成对照图谱，见图4。

图4 (A) 18批金樱子配方颗粒指纹图谱、(B)对照图谱

以4号峰为S峰，各峰的相对保留时间见表3。为了保证金樱子配方颗粒的质量，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算，规定供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不低于0.90。18批金樱子配方颗粒与对照指纹图谱的相似度分别为：0.997、0.991、0.995、0.990、0.993、0.970、0.968、0.998、0.994、0.972、0.961、0.981、0.970、0.968、0.962、0.983、0.965。

各批金樱子配方颗粒与对照指纹图谱的相似度均较高，满足规定要求。

表3 18批金樱子配方颗粒相对保留时间结果表

3 讨论

中药配方颗粒遵循中医基本理论的指导，运用现代制药工艺，将符合炮制规范的单味中药饮片经过加工煎煮、过滤浓缩、喷雾干燥等程序，制备成供中医临床上可随机组方、即冲即饮的颗粒剂型。其保留了原中药饮片的药性药效，具有无需煎煮，易于调剂，便于携带、运输、储存、服用等优点。通过大量的临床观察，其疗效显著，与传统汤剂药效基本一致。中药配方颗粒的疗效得到认可，但是国内的中药配方颗粒生产工艺、质量标准不统一，市场流通产品规格不同、质量差异较大。因此，建立统一的中药配方颗粒标准和生产质量管理规范至关重要。

金樱子配方颗粒薄层鉴别参考《中国药典》2015版中金樱子项下的鉴别方法，并且对方法进行了优化处理，结果供试品与对照药材均可得到对应的清晰斑点，说明金樱子配方颗粒中有效成分的含量稳定可控。

对其浸出物含量进行了测定，并检查了水分、粒度、溶化性。浸出物的平均值为44.1%，粒度、水分、溶化性均符合《中国药典》2015版中颗粒剂项下的相关规定要求。

金樱子具有抗氧化、抗肿瘤、降糖降脂、免疫调节、保护肾脏等多种药理作用[8]，有研究表明金樱子的多酚类成分能降低小鼠血清中血清胆固醇TC、三酰甘油TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C的含量，升高高密度脂蛋白胆固醇HDL-C的含量，抑制肥胖小鼠的体重增长。本研究建立了多酚类成分儿茶素含量测定的UPLC方法，并进行了方法学考察，结果表明：该方法准确可靠、稳定性好。同时采用该方法对18批次金樱子配方颗粒中儿茶素的含量进行了检测，计算得到18批样品中儿茶素含量的平均值为1.51 mg/g。中药指纹图谱是对某种或某产地的中药材或中成药进行分析，获得的能够表征中药材或中成药特性的共有峰的图谱，能较为全面地反映出中药所含化学成分的种类和含量，便于质量控制[9，10]。由18批金樱子配方颗粒的UPLC指纹图谱可见，其相似度均大于0.90，并指认了没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、鞣花酸峰的归属，该指纹图谱相似度高、稳定性好，可用于金樱子配方颗粒的质量控制。