基于网络药理学及分子对接预测木犀草素治疗痛风作用的研究

刘雅妮，牛红青

(1.桂林医学院附属医院全科医疗科，广西桂林 541001； 2.山西医科大学第二医院风湿免疫科，山西太原 030001)

痛风是一种由尿酸单钠(MSU)晶体沉积引起的晶体相关疾病，与尿酸排泄减少或嘌呤代谢紊乱引起的高尿酸血症直接相关。由于生活方式的改变和人口老龄化，痛风的发病率和患病率逐步升高，且呈年轻化趋势。许多证据表明，高尿酸血症和痛风是慢性肾病、高血压、心脑血管疾病及糖尿病等的独立危险因素，也是患者早期死亡的独立危险因素。痛风治疗的目的是缓解关节炎症状，降低血尿酸以防止急性发作和复发，并最大限度减少关节损伤和功能障碍，但目前用药仍存在争议。临床实践已证实传统中草药作为辅助治疗可能有益于痛风患者。因此，进一步寻找一种安全、有效的药物并探明其作用机制具有重要意义。黄酮类化合物广泛存在于自然界，具有多种抗炎、抗氧化、降尿酸、抗肿瘤等药理作用。木犀草素属于黄酮类化合物之一，是一种重要的中药活性成分，多以糖苷的形式存在于很多植物中。现已有研究发现木犀草素可缓解急性痛风性关节炎大鼠的关节炎症，但缺乏更多的机制研究。为进一步探讨木犀草素治疗痛风的潜在机制，本研究采用网络药理学的方法作一详细阐述。

1 资料与方法

从PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih)中获得木犀草素的SMILES结构式，用于靶点预测。

将木犀草素的SMILES结构导入Swiss Target Prediction数据库并以可能性(probability)>0为限制条件进行靶点筛选。分别在TTD数据库(http://db.idrblab.net/web/)、Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)中输入“gout”关键词搜索痛风疾病靶点，去除其他物种靶点及重复靶点后结合文献进行筛选，最终获得痛风疾病靶点。进一步将得到的药物靶点与疾病靶点取交集，获取二者的共同靶点，通过在线工具Calculate and draw custom Venn diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，拟定为木犀草素作用于痛风的潜在靶点。

将木犀草素与痛风的共同靶点上传至String在线平台(https://stringdb.org/)，选用Multiple proteins工具，限定物种为人类，置信区间为大于0.4，获得蛋白质靶点互作拓扑网络(PPI)。将结果导入Cytoscape3.9.0软件，利用cytohubba(MCC算法)插件筛选中心节点。

利用Metascape在线平台(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)对上述化合物和疾病共同靶点进行基因本体(GO)富集分析，物种选择H.sapiens，以<0.01为条件分别对生物过程(biological processes，BP)、细胞成分(cellular components，CC)和分子功能(molecular functions，MF)进行筛选，把得到的条目按值大小排序。同样方法再对所有共同靶点进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，得到主要相关通路(pathway)。

分子对接能有效预测化合物与靶点结合的可能性，将木犀草素化合物与1.3中获得的关键靶点蛋白进行分子对接。首先准备木犀草素配体文件，将1.2中获取的2D结构转换为mol2格式。准备受体文件，将潜在关键靶点输入蛋白质结构数据库(ProteinData Bank，PDB)(https://www.rcsb.org/)，下载靶蛋白的3D结构，去除配体、去除溶剂后保存为pbd格式。之后运用AutoDock4.2.6软件，设置Grid Box为整个蛋白分子，运行AutoDock4.2.6软件对化合物及靶点蛋白进行分子对接，得到结合能，以验证靶点与化合物的结合活性。最后用Pymol软件将对接结果进行可视化分析。

2 结 果

从Swiss Target Prediction数据库获得木犀草素作用靶点104个。TTD数据库、Drugbank数据库、DisGeNET分别获得痛风疾病靶点为18个、203个、205个。取交集后共获得木犀草素治疗痛风预测靶点19个(图1)，具体为：醛酮还原酶家族1B10(AKR1B10)、碳酸酐酶1(CA1)、甲状腺素运载蛋白(TTR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、多药耐药蛋白1(ABCB1)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)、醛糖还原酶(AKR1B1)、醛酮还原酶家族1成员C4(AKR1C4)、CXC趋化因子受体1型(CXCR1)、多药耐药相关蛋白1(ABCC1)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、醛酮还原酶家族1成员C3(AKR1C3)、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH)、3α-羟基类固醇3-脱氢酶(AKR1C2)、二氢二醇脱氢酶(AKR1C1)、细胞色素P4501B1(CYP1B1)、ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)。

图1 木犀草素治疗痛风潜在靶点韦恩图 图2 木犀草素治疗痛风潜在靶点PPI网络

将19个共同靶点上传至String在线平台，构建得到的蛋白互作网络关系图包括19个节点、32条边，平均节点度3.37、局部聚类系数0.6(图2)。使用Cytoscape的cytohubba插件筛选得到核心靶点基因共5个，分别为PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3。

将19个共同靶点上传到Metascape平台进行GO富集分析，结果显示木犀草素治疗痛风的潜在靶点分别被富集在烯烃化合物代谢、对脂肪酸的反应、视黄醇代谢、细胞对化学应激的反应、跨上皮转运、花生四烯酸代谢、对有毒物质的反应、对有机磷的反应、体液调节和细胞趋化10条生物过程(图3)；糖醇NADP氧化还原酶活性、ABC转运蛋白活性、血红素结合、铁离子结合和蛋白质二聚化活性5条分子功能(图4)；裂解液泡、顶端质膜、膜面和膜筏4条细胞组分(图5)。

图3 木犀草素治疗痛风潜在靶点GO富集(生物过程)结果

图4 木犀草素治疗痛风潜在靶点GO富集(分子功能)结果

图5 木犀草素治疗痛风潜在靶点GO富集(细胞组分)结果

在Metascape平台继续对木犀草素作用于痛风的预测靶点加以KEGG富集分析，发现关键靶点富集在7条通路上，包括卵巢类固醇合成、类固醇激素合成、ABC转运体转运、叶酸生物合成、化学致癌、内吞作用和癌症相关的通路(图6)。

图6 木犀草素治疗痛风潜在靶点KEGG富集结果

将木犀草素的2D结构与2.2中的关键靶点PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3对应的蛋白结构导入AutoDock4.2.6软件进行分子对接，对接结合能分别为-5.63、-3.97、-4.78、-5.99、-6.81。结果表明木犀草素化合物与这些靶点之间具有良好的对接活性。其中最有意义的靶点为PTGS2、ABCG2，将其对接结果进行可视化分析(图7、图8)。

图7 木犀草素与PTGS2分子对接 图8 木犀草素与ABCG2分子对接

3 讨 论

目前国际上通用的痛风急性期常用药物为秋水仙碱、非甾体抗炎药和糖皮质激素，降血尿酸药物为抑制尿酸合成的别嘌呤醇或非布司他、促进尿酸排泄的苯溴马隆或丙磺舒，以及分解尿酸的重组尿酸氧化酶。但从实际情况看，这些药物均存在一定弊端。中医药治疗痛风虽然有效，但药理机制尚不清楚，从而限制其传播。网络药理学是一种研究药物有效性和安全性的新思路，已成为中药研究和开发不可或缺的手段。本研究就是通过网络药理及分子对接分析木犀草素治疗痛风的潜在靶点，发现预测核心靶点包括PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3。其中，PTGS2、ABCG2最具临床意义。

痛风急性发作是由于尿酸钠晶体在关节等部位局部沉积导致的炎症反应，这时NLRP3炎症小体激活、白细胞介素(IL)-1β释放，并进一步导致其他促炎细胞因子和趋化因子的级联反应。在这一过程中，环氧合酶2(COX-2)可由单核巨噬细胞、成纤维细胞PTGS2基因迅速编码表达，通过花生四烯酸代谢途径参与炎症反应，是导致痛风炎性反应和组织损伤的关键酶之一。而花生四烯酸的代谢产物主要包括前列腺素(PG)和白细胞三烯(LT)等，它们均是重要的炎症因子，可导致发热、疼痛、血管扩张、通透性升高及白细胞渗出等炎症反应。现今最常用于缓解急性痛风炎症、疼痛和发热的选择性COX-2非甾体类抗炎药，就是通过选择性抑制COX-2活性而发挥作用。多个实验已表明，木犀草素能通过减少活性氧及活性氮合成、花生四烯酸代谢、NF-κB和MAPK等多种炎症通路抑制包括COX-2在内的炎性细胞因子表达，从而降低疾病的炎症反应，但在痛风的研究相对较少。本研究则通过筛选核心靶点，预测木犀草素同样能够通过PTGS2靶点抑制COX-2的表达，从而缓解痛风急性炎症反应。经GO富集分析也进一步发现木犀草素治疗痛风的主要生物过程包含花生四烯酸(AA)代谢过程。

痛风发病与ABCG2基因多态性有关。其编码蛋白属于ABC(ATP结合盒)转运超家族并具有穿过膜输送多种底物的能力，是尿酸排出转运蛋白的一种，不仅在肾近端小管细胞的顶端刷状缘膜表达，也在肠上皮细胞中高度表达，在肾脏和肾外尿酸排泄中发挥重要作用。近年来，越来越多的研究发现ABCG2在肠道尿酸排泄和高尿酸血症的发病机制中起着尤为重要的作用。LIU等更是指出，血尿酸水平之所以存在性别差异是因为雌二醇可以促进肠道ABCG2的表达，从而促进尿酸排泄。很多黄酮类化合物即是通过抑制黄嘌呤氧化酶、促进ABCG2基因表达等方式发挥降血尿酸作用。其他很多类型ABC跨膜转运蛋白在人体也广泛分布，ABCB1编码的蛋白就是该超家族的成员之一，可通过细胞外膜和细胞内膜转运药物等各种分子，负责细胞内稳态。本研究预测木犀草素能够通过作用于ABCG2、ABCB1靶点治疗痛风，由此推测其还可通过降低尿酸等发挥抗痛风作用。而且，经GO富集分析和KEGG富集分析发现主要分子功能和关键信号通路均包含ABC转运体及卵巢类固醇合成途径。

另外，痛风时破骨细胞的分化和活化均明显增强。SRC编码的原癌基因酪氨酸蛋白激酶则能够与PTK2B/PYK2一起在破骨细胞骨吸收中发挥重要作用，还可通过激活线粒体细胞色素C氧化酶促进破骨细胞的能量产生。木犀草素通过作用于该靶点，则可能发挥抑制痛风骨破坏的作用。AKR1C3编码醛酮还原酶1C3，该酶不仅参与体内类固醇激素的代谢，还可通过还原前列腺素D2为11β-前列腺素F2参与炎症反应。木犀草素等黄酮类化合物均对AKR1C3存在抑制作用，可见它还可以通过该途径抑制痛风炎症反应。

本研究最后还对木犀草素与上述核心靶点进行了分子对接，发现均有较好的结合活性，进一步证实了木犀草素可通过这些靶点发挥治疗痛风的作用。其中，作用于PTGS2及AKR1C3靶点可能通过花生四烯酸代谢通路抑制痛风急性发作时的炎症反应；作用于ABCG2及ABCB1靶点则可能通过ABC转运体通路增加尿酸的排泄；作用于SRC靶点则参与痛风破骨细胞的功能调节。

综上所述，本研究借助网络药理学工具，系统阐释了木犀草素治疗痛风的作用机制，并利用分子对接方法初步验证了木犀草素化合物与其治疗痛风潜在关键靶点发生相互作用的分子基础。虽然，网络药理学作为一种研究中药机制的新工具，可以帮助我们快速、有效地找到药物治疗疾病的靶点，能够在一定程度上减少筛选实验，有利于节约成本，但它主要依赖于现有的生物信息数据及计算机模拟算法，故无法预测木犀草素其他潜在的抗痛风作用，而且相应结果缺乏体内和体外的实验室依据，仍旧存在一定的研究局限性。因此，下一步可以考虑进行上述靶点相关的实验室研究为木犀草素治疗痛风提供更多的科学依据。