复配营养强化剂中维生素A和α-维生素E皂化液的稳定性考察

◎ 南利华，聂阿真，赵雪峰，魏 卓，李梦雨，贾松涛，赵林萍

（1.河南中标检测服务有限公司，河南 郑州 450001；2.郑州中道生物技术有限公司，河南 郑州 450001）

营养强化剂是为增加食品的营养成分（价值）而加入食品中的天然或人工合成的营养素和其他营养成分[1]。维生素A和维生素E作为营养强化剂，主要应用于奶粉、米粉中，是人体必不可少的营养成分。维生素A是一种脂溶性维生素，化学式C20H30O，分子量286.45，维生素A易被氧化，紫外线可促进其氧化破坏，故检测过程中需要避光，一般的加热、碱性条件和弱酸性条件下维生素A比较稳定[2-4]。α-维生素E是一种脂溶性维生素，化学式C29H50O2，分子量430.71，透明油状液体，无色或几乎无色或浅黄色或浅黄绿色，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。α-维生素E多溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热及酸稳定，对碱和紫外线 敏感[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复配营养强化剂（维生素A 1000 μg·g-1，α-维生素E 20000 μg·g-1）。

氢氧化钾、无水乙醇、维生素C、无水乙醚、石油醚（沸程：30～60 ℃）、无水硫酸钠、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT），以上试剂为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；甲醇，色谱纯，Fisher；实验用水为高纯水；pH试纸，指示范围1～14。

1.2 仪器与设备

有机系过滤头（孔径0.22 μm，津腾）；恒温水浴振荡器（SHZ-C）；万分之一分析天平（FA2204B）；十万分之一分析天平（OHAUS DV215CD）；分液漏斗萃取净化振荡器（RZK-C1000）；可见-紫外分光光度计（TU-1901，北京普析）；旋转蒸发仪（RE-52AA）；高效液相色谱仪（赛默飞U3000），带二极管阵列检测器。

1.3 标准溶液的配制

维生素A标准储备溶液（500 μg·mL-1）及α-维 生素E标准储备溶液（1000 μg·mL-1）：分别称取适量维生素A标准品和α-维生素E标准品于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

维生素A和α-维生素E混合标准工作溶液：分别准确吸取维生素A标准储备溶液和α-维生素E标准储备溶液，用甲醇逐级稀释。维生素A的浓度点为0.2～10.0 μg·mL-1，α-维生素E的浓度点为 2.0～80.0 μg·mL-1，临用配制。

1.4 样品前处理

1.4.1 皂化

精密称取0.3 g样品（精确至0.001 g）共12个，并分别置于12个150 mL棕色三角瓶中，沿每个三角瓶壁加入40～50 ℃高纯水20 mL（若瓶壁上沾有样品，需冲干净），混匀，加1.0 g维生素C，轻轻摇匀后加 1.0 g BHT，沿壁加入40 mL无水乙醇，摇匀后，沿壁轻轻加入50%的氢氧化钾溶液，边加边振摇，摇匀，加塞后，在80 ℃恒温水浴振荡器上皂化30 min（皂化过程中，要间断观察，避免瓶塞崩开，崩开后，需重新盖上，避免样品含量损失），皂化后立即用冰水冷却至室温。12个样品皂化液在暗处分别放置0 h、2 h、3 h、6 h、9 h及12 h后，分6组，每次2个平行样分别进行样品提取、洗涤、浓缩。

1.4.2 提取

将放置一定时间的样品皂化液转至分液漏斗中，加入50 mL石油醚无水乙醚混合液（1∶1），振荡萃取8 min，下层溶液转移至另一分液漏斗中，加入50 mL混合醚液再萃取，合并醚层。

1.4.3 洗涤与过滤

向分液漏斗中加入100 mL皂化液后，振摇，静置1 min，把下层水弃去，重复3次后至中性，用pH试纸检测第3次的下层水液中，pH为7左右。经装有无水硫酸钠（约10 g）的漏斗过滤到250 mL棕色平底烧瓶中。

1.4.4 浓缩

将平底烧瓶接在旋转蒸发仪上，于40 ℃水浴中减压蒸馏浓缩，待瓶中提取液剩下约2 mL时，取下平底烧瓶，立即用甲醇分次将平底烧瓶中的残留物溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，精密吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得。用有机系过滤头过滤到棕色样品瓶中，用高效液相色谱仪测定（第1组样品处理完毕后过滤到棕色样品瓶后，放置到4 ℃冰箱内，等样品完全处理完后，12个样品同时上机检测）。实验使用的所有器具均为干净干燥的棕色器具，处理过程中避免紫外光照，整个过程均在通风橱中操作。

1.5 色谱条件

色谱柱：C18柱（规格：250 mm×4.6 mm，粒径 5 μm）；柱温：35 ℃；流动相：甲醇；流速：1.0 mL·min-1；紫外检测波长：维生素A为325 nm；α-维生素E为293 nm；进样量：20 μL。

1.6 测定及计算

按上述条件进行样品测定，采用外标法定量，样品中维生素A或α-维生素E的含量计算公式如下：

式中：X为样品中维生素A或α-维生素E含量， μg·g-1；C为上机浓度，μg·mL-1；V为定容体积，mL；m为样品称样量，g；f为稀释倍数，mL。

2 结果与分析

2.1 维生素A和α-维生素E谱图

维生素A和α-维生素E谱图见图1、图2。

图1 维生素A谱图

图2 α-维生素E谱图

2.2 标准曲线

将1.3维生素A和α-维生素E标准品溶液注入高效液相色谱仪中测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见图3和图4。

图3 维生素A校准曲线图

图4 α-维生素E校准曲线图

2.3 皂化液的稳定性考察

从表1可以看出，皂化液放置时间的长短对维生素A几乎没有影响，结果偏差均小于10%，但直接影响α-维生素E含量，随着放置时间的增加含量逐渐降低，从放置时间3 h以后，α-维生素E含量偏差分别为22.49%、34.90%、44.81%、50.50%。

3 结论

试验结果证明，经《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》（GB 5009.82—2016）处理出来的皂化液放置时间的长短对维生素A几乎没有影响，结果偏差均小于10%，但直接影响α-维生素E含量，随着放置时间的增加，α- 维生素E的含量逐渐降低，放置3 h以后，α-维生素E含量偏差均大于10%。处理食品中营养强化剂或其他样品时（如奶粉、米粉），α-维生素E对碱敏感，为确保数据的准确性和可靠性，样品皂化液放置时间尽量控制在2 h以内，皂化液尽量在冰水下迅速冷却至室温。样品多的情况下建议边提取边皂化，不要一次性皂化完毕。