两种方法检测桶装饮用水回收桶中铜绿假单胞菌的结果比较

◎ 朱伟珍

（广东省汕头市质量计量监督检测所，广东 汕头 515041）

近年来，多地市场管理局对包装饮用水的监督抽检中发现其不合格率比较突出。其中，桶装饮用水中铜绿假单胞菌检出率远高于其他包装形式的饮用水。有调查指出，桶装饮用水中铜绿假单胞菌超标的部分原因是回收桶清洗不充分。因受到生产工艺及生产成本的限制，目前绝大部分生产企业均采用回收桶清洗消毒再利用。回收桶在运输、销售以及使用过程中不可控因素较多，故此类污染难以避免[1-4]。包装饮用水铜绿假单胞菌项目不合格的问题困扰着生产企业，实验室也时有接到生产企业咨询关于回收桶中污染铜绿假单胞菌的问题。在广东省汕头市质量计量监督检测所开展“提质强企”质量技术帮扶的行动中，笔者实地调研了当地一家包装饮用水生产企业，从该企业的回收桶存放场所随机抽取6只回收桶，并对其进行铜绿假单胞菌项目检测试验。

我国现行铜绿假单胞菌的检测标准有《食品国家安全标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）[5]，该方法为滤膜法，此外还有《化妆品安全技术规范》（2015年版）[6]和《一次性使用卫生用品卫生标准》（GB 15979—2002），这两个标准的方法均为定性检测法。由于3个标准都是对应特定的产品类型，回收桶不属于这些产品的范围，检测该项目只可参考执行。本试验采用了前两个较新且方法不同的标准进行试验，并对检测结果进行分析比较，以确立一种较为适合该项目的检测方法，帮助企业把好质量关，同时为后期开展该项目的检测工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源和标准菌株

6只回收桶是从当地一家生产企业的回收桶存放场所随机抽取；铜绿假单胞菌ATCC 27853（广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心 食品安全菌种保藏中心）。

1.2 试剂

CN琼脂培养基、乙酰胺肉汤、金氏B培养基、绿脓菌素测定用培养基、氧化酶试剂、十六烷三甲基溴化铵琼脂、乙酰胺培养基、明胶培养基和营养琼脂，均购自北京陆桥技术有限公司，验收合格且在有效期内。

1.3 仪器与设备

YM75立式压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）；MFS-3A-250-K不锈钢多联过滤系统（广东环凯微生物科技有限公司）；BHC-1300IIA/B2生物安全柜、SW-CJ-1Cu净化工作台（苏州净化设备有限公司）；BPX-272电恒温培养箱（上海博迅实业有限公司）；WGZ-2XJ细菌浊度计（上海昕瑞仪器仪表有限公司）

1.4 试验方法

1.4.1 样液制备

无菌操作往6只回收桶各加入260 mL无菌PBS，清洗回收桶内壁包括桶盖，将洗液收集于6个无菌锥形瓶备用。

1.4.2 菌悬液制备

吸取5 mL PBS加入铜绿假单胞菌标准菌株斜面（24 h新鲜培养）中，反复吹吸，洗下菌苔。用吸管吸取洗液转移到无菌试管中，用漩涡振荡器混合均匀后稀释配制成菌悬液，用细菌浊度计测定浓度，用PBS稀释制备成约103CFU·mL-1浓度备用。

1.4.3 样品检测

（1）滤膜法。检测步骤参照《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016），取250 mL回收桶洗液，通过孔径0.45 μm滤膜过滤，贴在已制备好的CN琼脂平板上，将平板倒置于（36±1）℃培养40～48 h，并防止干燥。分3种情况进行确证试验。①对于显蓝色或绿色（绿脓色素）的疑似菌落，需要做绿脓菌素确证试验，阳性判为检出。②对于产荧光不产绿脓色素的疑似菌落，进行乙酰胺肉汤确证试验，阳性判为检出。③对于显红褐色不发荧光的疑似菌落进行氧化酶测试、乙酰胺肉汤和金氏B培养基确证试验，试验均为阳性结果判为检出。根据以上3种情况计算每250 mL水样中铜绿假单胞菌的数量。

（2）定性检测法。检测步骤参照《化妆品安全技术规范》（2015年版），取10 mL回收桶洗液加入 90 mL SCDLP液体培养基中，置于（36±1）℃恒温培养18～24 h后，划线分离于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板和乙酰胺培养基平板，如有可疑菌落，进行染色镜检、氧化酶、绿脓菌素、硝酸盐还原产气、明胶液化和42 ℃生长确证试验。经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素皆为阳性者，即可报告检出；如绿脓菌素为阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42 ℃ 生长三者皆为阳性，仍可报告检出铜绿假单胞菌。

1.4.4 加标检测

取制备成约103CFU·mL-1浓度标准菌株菌悬液，吸取0.1 mL加入260 mL无菌PBS中，根据梯度稀释，制作加标试验。按1.4.3进行检测。

1.4.5 菌悬液实际浓度活菌计数

取制备成约103CFU·mL-1浓度标准菌株菌悬液，吸取1 mL作适当稀释后，各接种两个营养琼脂平板和CN琼脂平板，同时设空白对照，培养后，进行活菌计数。

2 结果与分析

2.1 样品检测结果

由表1可知，使用滤膜法检测，1#、3#、6#回收桶洗液滤膜上各有4个、11个、9个显蓝绿色的典型菌落，经绿脓菌素确证试验，结果均为阳性判为检出；2#、4#、5#和6#存在其他可疑的菌落，挑取菌落进行确证试验，结果非铜绿假单胞菌。使用定性检测法，1#、3#、6#回收桶洗液检出铜绿假单胞菌，其他洗液未检出。结果表明，滤膜法和定性检测法检测结果一致。

表1 两种方法铜绿假单胞菌检测结果表

由于回收桶的材质及结构上的特殊，试样处理方式不适合采用剪碎或擦拭，因此使用无菌PBS清洗后取洗液检测较为合适。本次试验同时采用两种方法，因每个回收桶样品都具备唯一性，只能用260 mL无菌PBS清洗回收桶内壁包括桶盖，将其作为样液进行试验。当实际检测只采用一种方法时，应按采用的标准来处理样液。滤膜法取250 mL回收桶洗液进行过滤后培养检测，定性检测法取10 mL洗液进行前增菌，使铜绿假单胞菌在低浓度时也可检出。此外，需注意使用清洗回收桶的无菌PBS不能过少，因回收桶较大，少量液体无法将桶内壁清洗干净，可能影响检测结果。对于滤膜法的检测结果，用250 mL和260 mL差别不大，如要准确计算可将检测结果乘以1.04。采用定性检测法时，建议在划线分离时先观察SCDLP增菌液的现象，当较为清澈时应适当延长至标准规定的最长时间24 h或26 h，使菌在增菌液中充分生长再取其划线分离，避免样液菌量浓度太低且未充分繁殖出现假阴性。

2.2 加标的检测结果

由表2可知，加入最高浓度约103CFU·mL-1的标准菌株菌悬液的滤膜上长有78个典型蓝绿色菌落，加入浓度4×10-1CFU·mL-1（以103CFU·mL-1为原液进行稀释）的标准菌株菌悬液的滤膜上长有1个典型蓝绿色菌落。用定性检测法在5×10-1、6×10-1梯度未检出铜绿假单胞菌，其他稀释梯度都检出。结果表明，滤膜法可检测低浓度至1 CFU/250 mL，定性检测法同样检出，结果一致。结合表1的试验结果可知，加标检测结果浓度涵盖了样品检测结果，推测不会出现漏检情况。

表2 铜绿假单胞菌加标检测结果表

2.3 菌悬液实际浓度活菌计数结果

用营养琼脂倾注平皿的103CFU·mL-1的标准菌株菌悬液实际浓度活菌计数800 CFU·mL-1，用CN琼脂倾注平皿计数为820 CFU·mL-1，空白无菌生长。计算滤膜法第1梯度吸取0.1 mL 103CFU·mL-1菌悬液过滤后结果为78 CFU·mL-1，相当于理论数量乘以10倍即为 780 CFU·mL-1。结果表明，用两种不同培养基倾注的结果与滤膜过滤的结果无明显区别，这可能与两种不同培养基均适合铜绿假单胞菌生长有关，铜绿假单胞菌在基本相同的环境下形成菌落的能力比较接近，且加入的菌液为24 h新鲜培养，菌的生长活力较强。试验的实际研究并不在此，仅作为试验的参考，实际目的在于观察菌悬液实际浓度与回收率（达95%以上），验证试验的准确性。空白无菌生长代表试验并没有受到污染，试验结果有效。

3 结论与讨论

铜绿假单胞菌是一种重要的水源和食源性条件致病菌，属于革兰氏阴性细长杆菌，大小为（1.5～3.0）μm× （0.5～0.8）μm，广泛分布于自然界，较其他细菌对消毒剂、干燥、紫外线的抵抗力强，在常温的水中可以存活数月。该菌几乎可以感染人体的任何组织和部位，可引起化脓性感染、菌血症、急性肠道疾病和皮肤炎症等。随着我国对铜绿假单胞菌的致病性及危害认识的不断深入，国家制定了相关政策。其中，《食品国家安全标准 包装饮用水》（GB 19298—2014）[7]于2015年5月24日起正式实施。该标准明确规定铜绿假单胞菌是必检项目之一且不得检出。由本次试验结果可知，确实存在桶装饮用水回收桶铜绿假单胞菌污染的问题。虽然本次试验污染铜绿假单胞菌的回收桶最少只有4 CFU，但一旦使用受污染的回收桶装水销售，水可提供有利于铜绿假单胞菌生长繁殖的条件，且随着存放时间的延长，水的铜绿假单胞菌污染会越来越严重。包装饮用水生产企业要生产合格的水，必须从水的源头到成品的每个环节层层把关，包括对回收空桶及桶盖进行彻底清洗消毒。检测回收桶中铜绿假单胞菌的方法必须以最严格的要求执行。因此，有必要通过试验确立一种适合桶装饮用水回收桶中铜绿假单胞菌的检测方法。

本次试验参照我国现行标准《食品国家安全标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）和《化妆品安全技术规范》（2015年版）对桶装饮用水回收桶中铜绿假单胞菌项目进行检测。前者为滤膜法，又称薄膜过滤法、膜过滤法、浓缩法，是以微孔滤膜截留液体样品中的微生物，并直接在滤膜上进行培养的微生物检验方法[8]。该方法的特点是大幅增加了取样量，能全面反映出样品中微生物的数量。铜绿假单胞菌的菌体最小为7.5 μm，标准方法中使用孔径0.45 μm的滤膜过滤样液，完全可以将其截留，检测结果可靠。后者为定性检测法，定性检测法也可称为“增菌培养法”，该方法是通过将样品处理液加入到适用于目标菌生长繁殖的液体培养基，借助人为创造的培养条件（如培养温度）使其快速生长繁殖的方法。该方法的特点是只要检测对象含有较少的目标菌，都能进行增菌繁殖，检出率极高。由本次试验可知，用滤膜法250 mL只检出1 CFU浓度的样液取10 mL进行前增菌，相当于取理论数量为0.04 CFU的菌通过增菌培养就可以检出目标菌，验证了该方法对目标菌浓度要求极低的特点。但该方法在菌量浓度过低的情况下，须延长增菌时间避免样液菌量浓度过低且未得到充分繁殖出现假阴性，且该方法只能达到定性检测，无法得到铜绿假单胞菌的准确数量。

《食品国家安全标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）的滤膜法和《化妆品安全技术规范》（2015年版）的定性检测法都是严谨可行的方法，两种方法各有特点，前者更贴合实际使用情况且更能够体现污染程度。