自然发酵“老面”与纯种发酵的糙米发糕挥发性成分及品质分析

许新月，李 君*，崔怀田，李佳怡，卢苗苗，张春丽，国宇轩，宋 虹，朱丹实，刘 贺

（1 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁锦州121013 2 辽宁阜新德美客食品有限公司 辽宁阜新 123000）

米发糕是我国南方传统主食之一，大多是以精制米为主要原料，通过接种发酵米浆或酵母菌作为发酵剂进行生产加工，因其松软适中的口感、丰富的营养价值以及大米独特的香味和酒香味而深受消费者的喜爱[1]。沈伊亮等[2]研究了不同原料对米发糕品质的影响，结果表明原料不同会导致米发糕的质构特性发生改变；李庆龙等[3]将粳米粉和籼米粉两种米粉材料混合制备发糕，产品品质较单一原料制备的样品好；郭蕾等[4]在米发糕传统发酵液中分离出发酵特性较好的植物乳杆菌和卡斯特酒香酵母，并开发了固态发酵剂；张印等[5]发现米面混合发酵工艺可明显改善传统发酵的米发糕品质。

糙米作为一种全谷物食品，不仅可以促进人体肠道中有益菌的生长繁殖，提高人体免疫功能，还具有预防心血管疾病、癌症的功能[6]，已逐渐成为食品领域开发和利用的热点。目前国内外相继开发了糙米饮料、糙米面包[7]、糙米面条[8]、速食糙米粉、糙米饼干等多种糙米制品[9]。“老面”是北方传统自然发酵剂，主要是发面蒸制馒头时剩下的一团面，在自然条件下发酵并密封冷藏而形成的具有多种微生物的野生菌体系[10]。许多研究者针对“老面”制品的品质、制作工艺和菌种组成[11]进行了研究，发现“老面”中的微生物主要是酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等微生物[12]，在发生糖化和酯化等反应时可使发酵制品具有良好的风味和口感[13-14]。然而，由于“老面”是在自然环境下通过手工发酵制成的，环境对发酵体系中微生物菌群产生的影响较大，造成其活性和比例的变化，进而导致菌群组成的演变，因此“老面”野生菌体系不确定性因素较多，质量不稳定，难以形成规模化的高质量工业化生产[15-16]。

本研究分别以自然发酵“老面”、酵母菌复配植物乳杆菌、酵母菌复配混合乳酸菌作为发酵剂，研制糙米发糕。同时，研究了与自然发酵“老面”风味等同的复配菌粉。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

碎米粉、糙米粉，盘锦光合蟹业有限公司；植物乳杆菌，西安百川生物科技有限公司；乳酸菌，北京川秀科技有限公司；无水乙醇（色谱纯级），国药集团化学试剂有限公司；小麦粉、小苏打、白砂糖、安琪酵母均采购于当地超市。

1.2 仪器与设备

TA-XT Plus 质构分析仪，英国Stable Micro System 公司；7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；PEN3 电子鼻，德国AIRSENSE 公司；固相微萃取手动进样手柄、DVB/CA/PDMS（50/30 μm）纤维头，美国Supelco 公司；THZ-D 台式恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 糙米发糕样品的制备 参考郭蕾等[17]的方法，并稍作修改。将糙米和碎米按照1∶2 质量比混合均匀、粉碎，以料液比为15∶11 的比例加水混匀，加入料液质量17%的白砂糖，接种（酵母菌复配乳酸菌粉、酵母菌复配植物乳杆菌、自然发酵“老面”）后于32 ℃恒温发酵，加入0.25%小苏打充分搅拌，注模，25 ℃醒发15 min，蒸制20 min，制备完成后备用。

1.3.2 质构的测定 测定条件：P/50R 探头，TPA模式，校正高度50 mm，测试前速度1 mm/s，测试中1 mm/s，测试后3 mm/s，压缩形变量35%，测试结果取3 次测定的平均值。

1.3.3 电子鼻的测定 PEN3 型电子鼻传感器由10 种不同的化学传感元件组成，不同传感器具有不同的性能（见表1）。称取10 g 样品于离心管中，密封，室温下静置30 min 后进行检测，每组样品重复测定3 次。参考Kachele 等[18]的方法对样品进行测试并稍作修改。具体参数如下：清洗时间110 s，样品准备时间5 s，测定时间120 s，载气流速350 mL/min，样品流速300 mL/min。通过电子鼻自带的软件对98 s 的数据进行分析。

表1 电子鼻传感器及响应物质Table 1 Electronic nose sensor and response substance

1.3.4 挥发性风味物质检测 在Lee 等[19]的基础上稍作修改。顶空SPME 条件：准确称取5.0 g 样品于SPME 顶空瓶中，密封，插入手动进样器，60℃水浴磁力搅拌器中平衡15 min，萃取头顶空萃取40 min 后收回纤维，移出萃取头并立即插入进样口（温度250 ℃）中，热解吸5 min 进样。GC 条件：HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯He（99.999%）；流量为15 mL/min；升温程序：初始温度40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 升温至100 ℃，以3 ℃/min 升温至220 ℃，保持14 min；不分流进样；溶剂延迟时间3.0 min。MS 条件：电子轰击（EI）离子源70 eV；离子源温度230℃；四级杆温度150 ℃；电压350 V；发射电流200 μA。

1.3.5 感官品评 按照组织结构30%、气味20%、滋味20%、色泽15%、黏弹性15%，制定糙米发糕感官评定标准（见表2）。评价小组由20 名（男、女各10 人）经过初级感官培训且具有食品专业知识的人组成，根据表中的评定标准对糙米发糕进行打分，去除最高及最低分后取平均分作为最终评定结果。

表2 感官评定标准Table 2 Sensory evaluation criteria

1.3.6 数据分析与处理 采用SPSS 19.0、Origin 8.0 以及Excel 软件对试验数据进行处理、作图及分析，数据以平均值和标准偏差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 质构特性分析

2.1.1 不同发酵剂添加量对糙米发糕质构特性的影响 对接种复配0.3%，0.6%，0.9%，1.2%，1.5%植物乳杆菌或乳酸菌，10%，16%，22%，28%“老面”制作的糙米发糕进行质构特性测定。质构特性的测定结果可以反映糙米发糕的感官品质，其影响主要表现为硬度与糙米发糕的品质呈现负相关，当硬度达到很大值时，发糕制品发硬口感较差[20]；弹性和凝聚性与发糕制品的品质呈正相关，弹性的大小影响着发糕的口感与组织状态；凝聚性的大小决定了发糕的咀嚼性，凝聚性大的发糕有嚼劲，而凝聚性小的发糕比较软烂口感不好。试验结果如图1所示，随着发酵剂添加量的增多，弹性和凝聚性均呈现先增大后减小的趋势，硬度总体呈现先减小后增大的趋势，而“老面”添加量对于硬度影响不大。酵母菌复配植物乳杆菌或乳酸菌，在发酵过程中发挥菌种协同作用，充分利用蛋白质、糖等大分子物质产生酸类等小分子代谢物，致使发酵产物更丰富，营养更全面。直链淀粉的含量是决定食用品质的关键因素，较低的淀粉含量在一定程度上会使食味变佳。微生物利用蛋白质使直链淀粉裸露出来，把淀粉粒包埋在其中，直链淀粉的增多使淀粉体系的凝聚性、弹性增强，从而改善糙米发糕的品质，而添加量过多时酵母产气过多，会使糙米发糕内部质地过于空洞，最终造成结构疏松软塌，致使弹性和凝聚性下降，硬度增大[21]；“老面”添加量增多，面筋含量随之增加，面筋网络结构包裹住发酵过程中产生的气体，同时“老面”中的优势菌，如酵母菌、乳酸菌发挥微生物协同作用，代谢分解蛋白质、糖类，作用于淀粉凝胶体系，从而使糙米发糕弹性和凝聚增加，而当添加量过多时，造成发酵过度，产生的气体溢出，破坏内部网络结构，糙米发糕表面塌陷，致使弹性和凝聚性下降。由图1可得，复配1.2%植物乳杆菌添加量或0.9%乳酸菌粉，“老面”添加量为16%时糙米发糕质构特性最佳。

图1 发酵剂添加量对糙米发糕质构特性影响Fig.1 Influence of the addition amount of starter on texture characteristics of brown rice cakes

2.1.2 发酵时间对糙米发糕质构特性影响 将复配植物乳杆菌、乳酸菌的发酵剂发酵时间控制在1，2，3，4 h，“老面”发酵时间控制在13，14，15，16，17 h。试验结果如图2所示，随着发酵时间的延长，弹性和凝聚性呈现先增大后减小的趋势，硬度总体呈现先下降后增大趋势，发酵后期硬度趋于平缓。发酵时间不足，酵母菌产气不足，乳酸菌不能充分利用蛋白质、脂肪等大分子物质，直链淀粉含量低，凝胶网络结构不稳定，导致弹性、凝聚性较小。随着发酵时间延长，不同菌种间发挥协同作用，充分利用蛋白质、糖类、脂肪等物质，使支链淀粉末端脱落，直链淀粉游离出来，直链淀粉的含量增多且进行有序排列，增大了淀粉体系的凝胶强度，最终导致内部结合力增大形成气孔致密、蓬松的蜂窝状结构[22]。乳酸菌发酵产生的有机酸、多糖等物质也能与酵母菌相互作用，会对糙米发糕的发酵特性和品质产生多方面的影响[23]，从而使弹性和凝聚性逐渐增大，硬度减小，而发酵时间过长，产酸量过多，导致发酵作用减弱，同时对酵母菌产气能力和糙米发糕凝胶网络的持气性产生影响，使弹性和凝聚性值下降；“老面”体系中的多种微生物发挥糖化、发酵、酯化的协同作用，产生二氧化碳，形成多孔结构，使组织结构更趋于柔软细腻而富有弹性的口感[24]，而随着发酵时间的延长，微生物体系中乳酸菌、醋酸菌等菌种的生长过快，改变了面团的环境，抑制酵母菌的生长，产气能力降低[25]，同时还可能由于发酵过度导致糙米发糕的持气力降低，糙米发糕表层塌陷，内部气孔不均匀，比容减小，使产生的气体溢出，发糕体积无法增大，影响发糕的品质，从而致使硬度值增大，弹性和凝聚性下降。综上，复配植物乳杆菌或乳酸菌发酵时间为3 h，“老面” 发酵时间为15 h 时制作的糙米发糕质构特性最佳。

图2 发酵时间对糙米发糕质构特性影响Fig.2 Influence of fermentation time on texture characteristics of brown rice cakes

2.2 电子鼻分析

2.2.1 植物乳杆菌发酵对挥发性气味的影响 电子鼻检测系统对于样品中挥发性风味物质的微量变化十分敏感，并通过响应值的变化反应风味物质的变化[26]。响应值表示传感器的相对电阻率（G/G0）变化趋势[27]。

由图3可知，植物乳杆菌不同添加量、不同发酵时间对应的糙米发糕香气外部轮廓不同，说明不同添加量和发酵时间产生的挥发性风味物质存在显著差异。由图3可知，R2 传感器的响应值变化较显著，说明样品中氮氧化物含量较高。植物乳杆菌添加量为0.3%和0.6%时氮氧化物含量无明显差异，添加量在0.9%和1.2%时氮氧化物含量最多，且两种添加量对于氮氧化物的生成量没有明显差异。随着发酵时间的延长，氮氧化物含量虽逐渐增多，但在发酵3 h 和4 h 时无明显差异。由3a可得，传感器R8 变化显著，说明随植物乳杆菌添加量的增多，糙米发糕中醇类物质含量增多。由3b 可知，R5、R6、R8 变化较显著，说明糙米发糕中烃类、芳香类、醇类化合物含量变化较大，在3 h和4 h 时，醇类、芳香类化合物含量较高。分析原因可能是随着菌种植物乳杆菌添加量的增多和发酵时间的延长，酵母菌和植物乳杆菌充分发挥作用，将糖、蛋白质等物质转化为醇类、芳香类物质。综上，植物乳杆菌最适添加量为1.2%，发酵时间为3 h。

图3 植物乳杆菌发酵电子鼻雷达图Fig.3 Electronic nose radar diagram of Lactobacillus plantarum fermentation

2.2.2 乳酸菌发酵对挥发性气味的影响 由图4a 和4b 可知，随着混合乳酸菌添加量的增多、发酵时间的延长，R2 响应值的变化最显著，添加量1.2%时R2 响应值最大，其次为0.9%；发酵时间为4 h 时，R2 响应值最大，其次为发酵3 h，两者差值不大；由4a 和4b 可知，R5、R6、R8 值较大，表明样品中含有较多的烃类、醇类、芳香类化合物。随着乳酸菌添加量增多和发酵时间的延长，R8 随之增大，表明样品中醇类物质随之增多，而R5、R6无显著变化。

图4 乳酸菌发酵电子鼻雷达图Fig.4 Electronic nose radar diagram of lactic acid bacteria fermentation

2.2.3 自然发酵“老面”对挥发性气味的影响 由图5a 和5b 可知，随着“老面”添加量的增多、发酵时间的延长，R2 响应值的变化最显著，添加量在22%时R2 响应值最大，添加量在16%时与其无显著差异；发酵时间为16，17，18 h 时，R2 响应值无显著变化；由5a 和5b 可知R5、R6、R8 值较大，表明样品中含有较多的烃类、醇类、芳香类化合物，综上，“老面”最适宜的添加量为16%，发酵时间为15 h。

图5 “老面”发酵电子鼻雷达图Fig.5 Electronic nose radar diagram of ′old mouth′ fermentation

2.3 不同发酵剂的糙米发糕挥发性风味成分分析

根据以上质构性质、电子鼻的结果，优选2%酵母菌复配1.2%植物乳杆菌、2%酵母菌复配0.9%乳酸菌、16%的“老面”，按照糙米发糕制作工艺利用3 种发酵剂分别制作糙米发糕，利用GCMS 测定其挥发性风味成分。

由表3可知，酵母菌复配植物乳杆菌发酵糙米发糕总风味物质种类为24 种，其中有8 种醇类化合物，6 种酸类化合物，4 种醛类化合物，4 种酯类化合物，2 种酮类化合物；酵母菌复配乳酸菌糙米发糕共检测出26 种风味物质，6 种醇类化合物，7 种酸类化合物，4 种醛类化合物，5 种酯类化合物，3 种酮类化合物，还有一种吲哚物质；自然发酵“老面”的糙米发糕共检测出28 种风味物质，9 种醇类化合物，6 种酸类化合物，4 种醛类化合物，6 种酯类化合物，3 种酮类化合物。在发酵过程中，酵母菌、乳酸菌利用蛋白质、碳水化合物等物质产生挥发性风味物质，在乳酸菌的作用下，葡萄糖经糖酵解途径转化为丙酮酸，再经过柠檬酸代谢等一系列生物化学过程产生醇类、醛类、酸类、酮类化合物，这一系列挥发性化合物的产生对糙米发糕的滋味和风味起到了决定性的作用[28-31]。3种糙米发糕风味物质相对含量最多的是醇类，含量相差不大。醇类物质的产生与糖代谢、氨基酸代谢、甲基酮还原等反应相关[32]，醇类都具有芳香、植物芳香等特殊香气，与其它成分间存在协同作用，对风味产生有较大影响[33]。在发酵食品中菌种对于食品风味有重要的影响，“老面” 和复配混合乳酸菌体系中具有多种微生物，可以发挥多种微生物的协同作用，提高微生物对营养物质的利用度，使发酵产物更加丰富，营养更全面，所以呈现的风味物质会更多。虽然上述GC-MS 检测结果表明，两种复配菌粉发酵制作的糙米发糕风味物质总数少于“老面”的，但是缺少的几种风味物质含量较低，对于糙米发糕整体风味和感官无明显影响，所以以上两种复配菌粉可代替面肥制作糙米发糕。

表3 3 种糙米发糕的风味分析Table 3 Analysis of flavor of three kinds of brown rice cakes

2.4 糙米发糕挥发性物质及不同种类主成分及聚类分析

对于3 种接种不同发酵剂的糙米发糕挥发性物质及种类进行主成分分析，挥发性物质主成分及种类特征值和方差贡献率如表4、表5所示，载荷图如图6、图7所示。糙米发糕中挥发性风味物质主要集中在前4 个主成分，累计方差贡献率为97.282%，挥发性风味物质种类主要集中在前2 个主成分，累计方差贡献率为99.989%，较好地包含了原始信息数据总量。糙米发糕感官品评结果与乙酸丙酯、3-羟基-2-戊酮、乙偶姻、辛酸乙酯、壬醛等物质成正相关，而与2-甲基己酸、醋酸、苯乙醇、正丁醇、仲辛醇、异戊醇含量等呈负相关；与糙米发糕挥发性风味物质种类酮类、酯类呈显著正相关，而与酸类呈显著负相关。壬醛、乙偶姻呈绿菜花、乳脂气息[34]，赋予糙米发糕令人愉快的香气，壬醛可赋予糙米发糕一定的清香、果香香味，1-壬醛具有玫瑰的香气，2，3-丁二酮有奶油香味，苯甲醛能赋予产品坚果香、杏仁香[35]。图8为糙米发糕挥发性风味物质聚类分析图，对聚类分析图进行4 聚类分析时，从甘氨酸到辛酸7 种风味物质为聚为一枝，三羟基二戊酮到仲戊醇聚为一枝，壬酸单独聚为一枝，异戊醇到正己醇聚为一枝，其聚类分析结果与主成分分析载荷图中各物质分析结果一致。

图6 糙米发糕挥发性风味物质主成分载荷图Fig.6 Principal component load of volatile flavor substances in brown rice cake

图7 糙米发糕挥发性风味物质种类主成分载荷图Fig.7 Principal component load diagram of volatile flavor compounds in brown rice cake

图8 糙米发糕挥发性风味物质聚类分析Fig.8 Cluster analysis of volatile flavor compounds in brown rice cake

表4 3 种糙米发糕挥发性风味物质主成分特征值和方差贡献率Table 4 Principal component characteristic values and variance contribution rates of volatile flavor substances in three kinds of brown rice cakes

表5 3 种糙米发糕不同种类挥发性风味物质主成分特征值和方差贡献率Table 5 Principal component characteristic values and variance contribution rates of different kinds of volatile flavor substances of three kinds of brown rice cakes

2.5 感官评价分析

糙米发糕的感官评价结果如表6所示，对比3 种不同发酵剂蒸制发糕，发现用16%的“老面”发酵制作糙米发糕时感官评分最高，其次是0.9%混合乳酸菌，1.2%植物乳杆菌的糙米发糕，两种复配菌粉制作发糕的感官评价与" 老面" 无较大差别，均具有明显的酒香味和发酵香气，甜度适中，弹性较好，风味和滋味俱佳；同一种发酵剂使用不同添加量的感官评价结果也具有显著差异，酵母菌与0.9%混合乳酸菌或1.2%植物乳杆菌混合、16%“老面”发酵蒸制的发糕风味较好。

表6 糙米发糕的感官评价结果Table 6 Sensory evaluation results of brown rice cakes

3 结论

本试验应用GC-MS、电子鼻检测技术，结合主成分分析和聚类分析研究自然发酵“老面”和纯种发酵的糙米发糕中挥发性风味物质。挥发性风味物质主成分分析和聚类分析结果表明：感官评定结果与乙酸丙酯、3-羟基-2-戊酮、乙偶姻、辛酸乙酯、壬醛呈显著正相关，赋予糙米发糕乳脂味、清香味、果香味；挥发性物质种类主成分分析结果表明：感官评定结果与酮类、酯类呈显著正相关。同时，结合糙米发糕质构特性对比分析，结果表明：2%酵母菌复配1.2%植物乳杆菌、2%酵母菌复配0.9%乳酸菌发酵3 h，16%“老面” 发酵15 h，3种糙米发糕挥发性风味物质相近且质构特性最佳。由此可以确定纯种发酵基本可以代替自然发酵“老面”制作糙米发糕，且糙米发糕风味和感官良好，最终确定了糙米发糕的制作工艺和复配菌间配比。糙米发糕工艺配方：糙米粉：碎米粉=1∶2，绵白糖17%，去离子水73%，发酵剂（2%酵母菌复配1.2%植物乳杆菌或0.9%乳酸菌粉，发酵3 h；“老面”16%，发酵15 h），小苏打0.25%。