纳豆及其制品的安全性研究

王露露，李 斌，彭雪菲，陈楠楠，曹梦思，刘 明*，郭新光，别小妹

（1 中国食品发酵工业研究院 北京 100015 2 南京农业大学食品科技学院 南京 210095 3 食品行业生产力促进中心 北京 100015）

纳豆是由纳豆芽孢杆菌发酵豆类而成的一类发酵食品[1]，在发酵过程中会产生纳豆激酶（Nattokinase，NK）、维生素K2、异黄酮、超氧化物歧化酶（SOD）等活性物质[2]，可以溶解血栓[3]，预防骨质疏松[4]，降血压[5]，降血脂[6]，减脂助消化[7]，免疫调节[8]等。纳豆芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌的亚种，研究表明，枯草芽孢杆菌可以有效抑制动物肠道内致病菌[9]，调节肠道菌群平衡[10]，提高机体免疫力[11]，促进酶类及B 族维生素合成，进而提高食物的消化吸收利用率[12]等。

发酵食品是否安全，与发酵菌株和生产工艺密不可分。一般来说，发酵工艺条件可控，具有较高的安全性，然而，发酵菌株的安全性、有毒有害代谢产物及杂菌的污染不可避免地会增加食品安全风险[13]。随着抗生素在人和动物中持续过度的使用，甚至滥用，肠道致病菌或非致病菌产生耐药性或携带耐药基因，可传递或转移给肠道内其它细菌，对环境及人体健康造成威胁[14]。目前细菌的耐药性俨然成为影响公众卫生安全的问题。然而，大多数耐药性研究聚焦在致病菌的药物敏感性，有关非致病菌耐药性的研究很少，枯草芽孢杆菌与常见抗生素相互作用的研究更是寥寥。纳豆及其制品中有大量活性菌随产品的摄入进入人体，如果其存在可转移耐药基因，就有可能引起人体肠道致病菌产生耐药性，对人体造成安全威胁。

传统发酵食品一般不会存在安全性问题，然而，在食品发酵过程中生物胺（Biogenic Amines，BA）的积累很难控制[15]。适当的BA 对人体的各项生理机能具有调节作用，当BA 代谢能力饱和或代谢活性被特异性地减弱或抑制时，会在人体内大量积累，可能会发生食物中毒[16]。目前各国对食品中BA 的限量标准不一，我国尚未对各类食品BA 含量作出要求。王充等[17]对豆豉、豆酱、酱油3种大豆发酵制品的8 个样品中生物胺含量进行检测，发现50%的样品中组胺含量超过美国食品药品监督管理局确定的危害水平（500 mg/kg）。Yang等[18]对市售大豆和豆腐中生物胺含量进行研究，发现30 种发酵大豆样品中有8 种存在生物胺不安全性，组胺、酪胺和β-苯乙胺的含量达到威胁人类健康的水平，豆腐中的腐胺含量也存在安全隐患。由此可见，发酵纳豆中也可能存在过量积累BA 的风险。目前有关发酵豆制品中BA 的研究多集中在发酵初制品的检测，缺少终产品中生物胺含量的数据。

本文通过纸片法研究8 种常见抗菌药物对14 株枯草芽孢杆菌的最低抑制浓度（MIC 值），采用液相色谱法测定市售纳豆及其制品生物胺含量。根据菌株耐药性和产品的生物胺含量评价纳豆及其制品的安全性，为尽快实现其安全性的标准化评价方法提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品 20 种纳豆及其制品，购自北京、广东、西安、大连等市场。

1.1.2 菌株 枯草芽胞杆菌枯草亚种（CICC 10023），中国工业微生物菌种保藏管理中心。金黄色葡萄球菌（ATCC29213），本实验室保藏。

1.1.3 培养基 LB 肉汤培养基，用于种子培养；LB 固体培养基，用于菌株划线纯化；MHA（Mueller-Hinton Agar），用于抗生素敏感试验；PCA（Plate Count Agar），用于平板计数。

1.1.4 试剂 抗菌药物（环丙沙星、氯霉素、美罗培南、头孢他啶、头孢曲松、氨苄西林、庆大霉素、四环素），购自中国食品药品检定研究院；生物胺标准品（腐胺、尸胺、组胺、2，4，6-三甲基苯乙胺、酪胺、亚精胺、精胺）、1，7-二氨基庚烷内标标准品、丹磺酰氯衍生剂，购自美国Sigma 公司；乙腈（色谱纯级），德国CNW Technologies 公司；丙酮（色谱纯级），韩国DUKSAN 公司。其余试剂均为国产分析纯级。

1.1.5 仪器与设备 恒温培养箱，德国MEMMERT 公司；GR60DA 高压灭菌锅，厦门致微仪器有限公司；MQL-61R 立式振荡培养箱，上海旻泉仪器有限公司；CX33 光学显微镜，日本Olympus Corporation 公司；HC-3518 高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；T-Gradient 梯度PCR 仪、琼脂糖凝胶电泳仪，德国BIOMETRA 公司；Waters 2695 液相色谱仪，美国Waters 公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离与纯化 称取10 g 样品置于均质袋中，加入100 mL 无菌水均质5 min，80 ℃水浴30 min 除去杂菌，冷却至室温后取1 mL 上清液进行梯度稀释，分别取10-4，10-5，10-6，10-74 个梯度在LB 培养基上涂布，每个梯度3 个平行，37 ℃培养24 h，挑取疑似菌株的单菌落至LB 平板连续划线至得到大小均一的单个菌落。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 形态学观察 参照 《伯杰氏细菌鉴定手册》解释标准，观察平板上单个菌落的大小形态、颜色、表面粗糙度、透明度、边缘整齐情况等。

1.2.2.2 生理生化鉴定 以枯草芽孢杆菌亚种（CICC 10023）作为对照，按照鉴定芽孢杆菌生理生化鉴定试剂盒的使用说明，进行12 种生理生化试验，观察试剂盒内各培养基颜色变化。

1.2.2.3 16S rDNA 鉴定 提取纯化的单菌落至LB 液体培养基中，37 ℃培养24 h，用DNA 提取试剂盒提取细菌DNA。以试剂盒提取的DNA 为模板，对其16S rRNA 进行PCR 扩增，采用通用引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′ ；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR 扩增体系：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.5 μL（10 μmol/L）上下游引物，1 μL 模板DNA，ddH2O 补足到25 μL，进行35 个循环。

PCR 扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳仪检测。选择明亮且清晰准确的条带DNA 交由生工生物工程股份有限公司进行16S rDNA 双向测序。对测序结果采用DNA MAN 软件拼接，登录NCBI利用Nucleotide BLAST 在线对样品序列结果进行序列同源性比对，下载数据库中获得的同源性比较高的菌株16S rDNA 基因序列信息，获得菌株的系统发育地位。

1.2.3 药物敏感性试验 将8 种抗菌药物稀释成试验所需的浓度，浸透自制无菌药敏片（8 mm×0.7 mm），37 ℃烘干备用。将甘油管内保存的菌株活化后，采用麦氏比浊法调整菌液浓度大约至1.5×108CFU/mL，再用生理盐水稀释100 倍（大约为105～106CFU/mL）。取100 μL 置于制备好的MHA 培养基，用一次性涂布棒涂至菌液完全被琼脂吸收，正置30 min，用无菌镊子夹取各浓度的耐药纸片平铺于平板，每个纸片的中心距离＞24 mm，纸片边缘距平板边缘＞15 mm，37 ℃恒温培养箱内孵育18 h。以金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）作为质控菌株，质控菌株和试验菌株的药敏试验结果必须符合美国临床和实验室标准化协会（CLSI） 颁布的最新版M100-2C 抗菌药物敏感性试验解释标准，确定明显抑制菌株生长的最低抑制浓度（MIC 值）。

1.2.4 生物胺含量检测

1.2.4.1 样品的提取 将各样品研磨至碎，准确称取5 g，置于50 mL 离心管中，加入10 mL 三氯乙酸超声提取30 min，6 000 r/min 离心10 min，取上清液转移至25 mL 容量瓶中，沉淀用10 mL 三氯乙酸重复提取、离心，取上清液转移至容量瓶后，用三氯乙酸定容至刻度。

1.2.4.2 衍生及测定 样品及生物胺标准系列溶液的衍生参考GB 5009.208-2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》[19]。

1.2.4.3 色谱条件 色谱柱为C18 柱 （柱长250 mm，柱内径4.6 mm，柱填料粒径5 μm），紫外检测波长254 nm，进样量20 μL，柱温35 ℃，流动相A：90%乙腈和10%乙酸铵溶液 （0.01 mol/L，含0.1%乙酸），流动相B：10%乙腈和90%乙酸铵溶液（0.01 mol/L，含0.1%乙酸），流速为0.8 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

2 结果与分析

2.1 菌株的分离鉴定

2.1.1 菌株的形态特征 在纳豆及其制品中共分离到14 株菌，编号分别为SD-1～SD-8、SDF-2、SDF-3、SDF-4、SDP-1、SDP-3、SDP-5。菌株的菌落形态及革兰氏染色结果如图1所示，菌落近似圆形，表面呈乳白色或浅黄色，湿润有皱褶，不透明，边缘呈叶齿状，与培养基紧密结合。菌体显蓝紫色，属革兰氏阳性菌，短杆状，单个或链状排列，菌体内有芽孢。

图1 菌株的菌落形态及细胞形态Fig.1 Colony and cell morphology of strain

2.1.2 生理生化鉴定 如表2所示，14 株菌的生理生化结果与阳性菌株CICC 10023 各项指标相同，符合《伯杰细菌鉴定手册第8 版》、《常见细菌系统鉴定手册》中芽孢杆菌的特性描述，结合菌株的形态特征，可以确定14 株菌为芽孢杆菌属。

表2 菌株的生理生化鉴定Table 2 Physiological and biochemical identification of strains

2.1.3 16 S rDNA 鉴定 利用DNA 基因组提取试剂盒在无菌环境下提取各菌株的DNA 后，PCR 扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，结果显示其碱基对数目为1 400 bp 左右，说明扩增成功，菌株NDA 扩增条带如图2。

图2 DNA 琼脂糖凝胶电泳Fig.2 DNA agarose gel electrophoresis

13 株菌完成了双向测序，Seq Man 软件拼接后，各菌株的16S rDNA 全长在1 460 bp 左右。将13 株菌的序列分别使用BLAST 在基因库中进行同源性在线搜索，确定13 株菌均为枯草芽孢杆菌。

2.2 药物敏感性试验

如表3所示，分离到的14 株枯草芽孢杆菌中，只有SD-7 菌株未表现出对任何一种抗菌药物的耐受性，其它菌均表现出不同程度的耐药。SD-1、SD-2、SD-4、SD-8、SDF-4、SDP-5 菌株对头孢他啶表现出高度耐受性，SD-6、SDF-2、SDP-3表现为轻微耐药性，其余均对头孢他啶高度敏感。SDF-2 和SDP-1 对环丙沙星表现出高度耐受性，SD-3 表现为轻微耐药性，其它均对环丙沙星敏感。美罗培南对SD-2、SDP-5 的MIC 值为8 μg/mL，表现为轻微耐药，对其余12 株菌则抑制作用明显。14 株菌对头孢曲松和庆大霉素高度敏感，表明均未携带头孢曲松和庆大霉素抗性基因。SD-2、SD-3、SD-7、SDF-2、SDP-1 对氯霉素敏感，其它菌株均表现为轻微耐药。因为CLSI 中未规定氨苄西林对芽孢杆菌属类细菌的MIC 值，8 μg/mL 的质量浓度未观察到对菌株的抑制作用，无法判定菌株是否耐药。

表3 常见抗菌药物对各菌株的MIC 值（μg/mL）及敏感性判断Table 3 MIC value （μg/mL） and sensitivity judgment of common antimicrobial agents against each strain

2.3 生物胺含量检测

如图3所示，7 种生物胺标准品在37 min 内全部出峰，且各生物胺之间都能得到很好的分离，出峰顺序及保留时间分别为腐胺18.570 min、尸胺20.201 min、组胺21.319 min、2，4，6-三甲基苯乙胺26.183 min、酪胺28.242 min、亚精胺29.401 min、精胺35.466 min。

图3 生物胺混合标准品液相色谱图（25 mg/L）Fig.3 Liquid chromatography of mixed standard of biogenic amines （25 mg/L）

由表4可知，7 种生物胺标准品回归方程的相关系数R2＞0.9963，说明标准曲线呈良好的线性关系，以3 倍和10 倍的信噪比分别确定7 种生物胺的检出限和定量限分别在0.033～0.167 mg/L 和0.112～0.558 mg/L，7 种生物胺回收率在90.2%～113%之间。同时进行6 个平行样品，7 种生物胺的相对标准偏差（RSD）范围为0.085～0.016 之间，说明该方法具有良好的精密度，所选液相色谱仪能满足检测样品中生物胺含量的要求。

表4 液相色谱法测定生物胺标准品的特征参数Table 4 Characteristic parameters of biogenic amine standards by liquid chromatography

不同产品形式含有的生物胺种类及含量不同，8 种发酵纳豆生物胺总含量范围在8.48～162.16 mg/kg，8 种纳豆中均未检出2，4，6-三甲基苯乙胺。除ND-5 产品外，其它7 种纳豆均未检出组胺。同样是发酵大豆，ND-5 产品生物胺总含量高达162.16 mg/kg，ND-6 产品中生物胺含量仅8.48 mg/kg，每千克样品生物胺含量相差150 mg之多。6 种纳豆冻干粉生物胺含量范围在2.21～200.91 mg/kg，不同厂家的冻干粉生物胺含量也存在较大的差异。6 种纳豆糖果产品中生物胺含量范围在3.54～21.71 mg/kg，6 种糖果产品中均未检出组胺和2，4，6-三甲基苯乙胺。根据美国食品药品监督管理局（FDA）对食品中生物胺限量标准，20 种产品中生物胺含量均未超标，然而，ND-5 腐胺、尸胺含量较高，具有一定的安全风险，要注意控制食用量，过量食用可能影响人体健康。

3 讨论

纳豆及其制品中的活菌会随产品的摄入进入人体，一旦产生耐药性，其耐药基因极有可能会通过各种方式在不同种、属水平中产生转移，使肠道内致病菌产生耐药性[20]，同时枯草芽孢杆菌的益生作用也会逐渐被抑制，对人体健康造成威胁。本研究首次开展了分离市售纳豆及其制品中的优势菌株，通过制备不同质量浓度梯度的抗生素，研究8 种常见抗菌药物对产品优势菌的MIC 值。除SD-7 菌株外，其它菌均有不同程度的耐药，在检测菌株中有6 株对头孢他啶药物表现出高度耐受性，两株对环丙沙星耐受，9 株对氯霉素轻微耐药，说明菌株中可能存在这几类抗菌药物的耐受基因，因此，摄入含枯草芽孢杆菌的产品时，应注意和其敏感抗菌药物分开食用，同时需加强产品生产菌的耐药检测、监督、管理及控制。下一步可以根据报道的文献，研究不同菌株对不同药物的耐药机制及其耐药基因的转移规律，完善产品的食用安全性评价。

表5 样品生物胺含量测定结果（mg/kg）Table 5 Results of biogenic amines in sample groups （mg/kg）

纳豆发酵造成生物胺的累积不仅影响纳豆的风味和口感，在一定的条件下还可能转化成强致癌的亚硝胺，过量摄入会影响人体健康[21]。目前国内没有纳豆及其制品生物胺限量标准，同时有关研究中缺少关于终产品中生物胺含量的数据，本研究中以纳豆及其制品为研究对象，通过对产品中生物胺含量检测发现，同种产品形式生物胺含量存在较大差异，可能与选择的菌株与加工工艺有关。不同产品形式中生物胺种类及含量存在差异，纳豆糖果产品相对比发酵纳豆而言，生物胺含量减少，这可能与终产品加工过程中发酵菌株的总数减少有关，进一步说明影响生物胺产生的一个重要因素是发酵的微生物种类及数量。参照美国食品药品监督管理局（FDA）对食品中生物胺限量标准，各产品生物胺总含量虽然没有超标现象，但个别产品的生物胺含量具有一定的安全风险，有必要建立纳豆制品中生物胺含量限值。

以上结果表明，发酵纳豆类产品是具有安全风险的，应该重视发酵产品可能存在和产生的致病基因以及毒性代谢产物带来的风险。完善纳豆及其制品安全性的评价方法，开展产品发酵菌株耐药性研究和生物胺含量的检测是纳豆及其制品安全性的重要评价手段，将为提高产品的食用安全性提供保障。