川贝母对卵清蛋白致敏哮喘小鼠的作用及其机制

侯从岭，芦晓帆，雷小婷，唐引引，赵润杨，李彬

河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院肺病科，河南郑州 450002

支气管哮喘是最常见的慢性气道炎症之一，其典型症状为持续性发作的气促、喘息、咳嗽和胸闷等[1]。哮喘致死率较高，其发病率在全球气道慢性疾病中居首位[2]。哮喘发作是气道狭窄的结果，气道狭窄可引起支气管肿胀、分泌物增加和肌肉收缩等。支气管哮喘发作通常由致敏原引起[3]，常见诱因包括过敏原(如烟草、花粉等)、气温变化和压力等。哮喘是由多种免疫细胞特别是T细胞引起的慢性气道炎症，其与辅助性T细胞1(T helper type1，Th1)/辅助性T细胞2(T helper type 2，Th2)及其分泌的细胞因子失衡密切相关[4]。Th2通过释放Th2型细胞因子如白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等，启动过敏性哮喘的免疫应答；而Th1通过释放Th1型细胞因子如γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)等，参与拮抗Th2细胞反应，抑制过敏性哮喘的进展[5]。因此，靶向调节Th1/Th2的平衡有助于从源头上缓解过敏性哮喘。另有研究发现，Janus激酶3(Janus kinase 3，JAK3)/信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信号传导途径与哮喘进程中Th1/Th2平衡调节相关[6-7]。Th2合成的炎性介质是JAK/STAT6通路的上游刺激因子，可诱导STAT6磷酸化，STAT6磷酸化参与杯状细胞化生，从而导致黏液分泌过多[8-9]。目前研究发现，多种天然中草药及中草药成分可通过调节そ1/そ2失衡治疗哮喘，如茯苓和人参皂苷等[10-11]。川贝母(Fritillaria cirrhosaD. Don)是一种多年生的百合科草本植物，具有清热化痰、润肺止咳、散结消肿的功效，以及降低血压和控制血糖的作用。有报道称，川贝母可减轻哮喘模型小鼠的气道炎症[12]，但其作用机制尚未完全阐明。值得注意的是，川贝母水提物可上调STAT家族蛋白的表达，并通过上调IL-12和IFN-γ来调节免疫应答，诱导肺癌细胞凋亡[13]。本研究探讨了川贝母对卵清蛋白(ovalbumin，OVA)致敏支气管哮喘小鼠的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 川贝母粉由成都市康华药业股份有限公司提供。提取川贝母粉7.0 mg、14.0 mg和21.0 mg，分别溶于5%羧甲基纤维素钠(carboxymethyl，CMC) 5 ml中，现用现配。OVA(A5253，100 g)、氢氧化铝凝胶(A8222，250 ml)(美国Sigma公司)；地塞米松磷酸钠注射液(5 mg/支，焦作市国药集团容生制药有限公司)；总RNA抽提试剂(Trizol)、反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)；总蛋白提取试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；兔抗JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6、IL-4抗体及山羊抗兔IgG抗体，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(美国Abcam公司)；酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)试剂盒(美国Kamiya公司)；增强型化学发光(ECL)试剂(美国Thermo公司)。超声雾化器(鱼跃402AI，重庆永健生物技术有限公司)；雾化箱(以有机玻璃为材料自制，规格：40 cm×30 cm×20 cm)；实时反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)仪(ABI 7300，美国ABI公司)；微量加样器(3112，德国Eppendorf公司)；自动平衡离心机(LDZ5-2，北京京立离心机有限公司)；电子天平(UW820S，日本岛津公司)；BH-2光学显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪(Elx800，美国Bio-Tek公司)。

1.2 实验动物 60只SPF级BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周龄，由河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院动物实验中心提供(实验动物生产合格证号：SCXK豫2019-022)。饲养温度为25 ℃，湿度为20%～25%，自由进食和饮水。实验过程符合国家和单位有关实验动物管理和使用的规定。

1.3 小鼠哮喘模型制备及实验分组 取50只小鼠，实验第1、8天分别腹腔注射0.2 mg OVA和1 mg氢氧化铝粉末制成的混悬液0.2 ml，即为首次致敏。实验第15天，将小鼠分别置于超声雾化器中，给予1%的OVA生理盐水喷雾雾化吸入，每周3次，每次20 min，持续4周，直至实验结束。小鼠出现腹肌痉挛、呼吸加快、站立不稳等症状表示激发成功。50只小鼠均激发成功。

将造模成功的50只小鼠随机分为OVA模型组(灌胃0.5%羧甲基纤维素钠)、地塞米松组(腹腔注射0.5 mg/kg地塞米松)及川贝母低、中、高剂量组(灌胃7.0、14.0、21.0 mg/kg川贝母)，每组10只；余10只正常小鼠作为空白对照组(用等体积的生理盐水代替OVA处理，灌胃0.5%羧甲基纤维素钠)。每天给药1次，连续给药4周。

1.4 小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎性细胞计数及BDNF含量测定 给药结束后，各组小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉，剪开皮肤，分离气管并做一横向切口，插入气管插管。结扎右主支气管，经气管插管以10 ml生理盐水灌洗左肺，收集BALF，经2000 r/min离心15 min，弃上清液。取沉渣用1 ml PBS重悬，吸取10 μl加至血细胞计数板，在高倍显微镜下计数炎性细胞总数。取100 μl细胞悬液涂布在载玻片上，用迪夫快速染色液(Diff-Quik)染色后，进行分类细胞(中性粒细胞、酸性粒细胞和淋巴细胞)计数。

采用BDNF试剂盒检测BALF中BDNF的含量，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.5 气道酚红排泄量测定 末次给药后0.5 h，各组小鼠腹腔注射0.5%苯酚红溶液(20 ml/kg)，30 min后处死小鼠，剥离气管并取一段等长气管，放入含3 ml生理盐水的EP管中，取上清液加入0.1 ml 5%NaHCO3，采用紫外分光光度计测定546 nm处的吸光度值。

1.6 ELISA法检测血清中免疫球蛋白E(IgE)、IL-4、IL-13、IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)浓度 给药结束后，通过眼球采血采集各组小鼠血液1 ml，离心后取上清，测定血清中IgE、IL-4、IL-13、IFN-γ、TNF-α的浓度，操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.7 RT-q P CR 检测肺组织中J A K 3、STAT 6、IL-4mRNA的表达 取各组小鼠肺组织，按试剂盒说明书步骤提取肺组织总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行实时定量PCR，反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列：JAK3正义链5'-ACACCTCTGATCCCTCAGC-3'，反义链5'-GCGAATGATAAACAGGCAGGATG-3'；STAT6正义链5'-CCTGGTCGGTTCAGATGCTTT-3'，反义链5'-GTGCGGCAAGATGCTGTTTC-3'；IL-4正义链5'-CCCCAGCTAGTTGTCATCCTG-3'，反义链5'-CAAGTGATTTTTGTCGCATCCG-3'；Sirt1正义链5'-TGGCAAAGGAGCAGATTAGTAGG-3'，反义链5'-CTGCCACAAGAACTAGAGGATAAGA-3'。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达水平。

1.8 Western blotting检测肺组织中JAK3、STAT6、IL-4蛋白的表达 使用RIPA裂解液提取各组肺组织总蛋白，并溶解于SDS蛋白上样缓冲液中。取40 μg上样，行SDS-PAGE凝胶电泳，并转至PVDF膜上；用5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h，加入抗JAK3抗体(ab45141；1:300)、抗p-JAK3抗体(ab278789；1:500)、抗STAT6抗体(ab32520；1:300)、抗p-STAT6抗体(ab188080；1:1000)、抗IL-4抗体(ab62351；1:500)4 ℃孵育过夜；TBST漂洗后，加入HRP标记的IgG抗体(ab205718；1:1000)室温孵育1 h，ECL显影液曝光、定影后晾干拍照，以GAPDH为内参，用ImageJ软件进行蛋白定量分析。

1.9 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。实验数据以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Duncan检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 川贝母对OVA小鼠气道酚红排泄量和BALF中BDNF含量的影响 与空白对照组比较，OVA模型组小鼠气道酚红排泄量明显降低(P＜0.05)，BALF中BDNF含量明显增加(P＜0.05)。与OVA模型组比较，川贝母低、中、高剂量组小鼠气道酚红排泄量明显增加(P＜0.05)，BALF中BDNF含量明显降低(P＜0.05)；与地塞米松组比较，川贝母高剂量组小鼠气道酚红排泄量及BALF中BDNF含量无明显变化(P>0.05)；与川贝母低剂量组比较，川贝母高剂量组小鼠气道酚红排泄量明显增加(P＜0.05)，BALF中BDNF含量明显降低(P＜0.05) (表1)。

2.2 川贝母对OVA小鼠BALF中炎性细胞数量的影响 与空白对照组比较，OVA模型组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量及炎性细胞总数明显增多(P＜0.05)；与OVA模型组比较，川贝母低、中、高剂量组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量及炎性细胞总数明显减少(P＜0.05)；与地塞米松组比较，川贝母高剂量组小鼠BALF中炎性细胞数量无明显变化(P>0.05)；与川贝母低剂量组比较，川贝母高剂量组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量及炎性细胞总数明显减少(P＜0.05)(表1)。

表1 各组小鼠气道酚红排泄量、BALF中BDNF含量及炎性细胞数量比较(±s, n=10)Tab.1 Comparison of the Fritillaria cirrhosa on airway phenol red excretion, BDNF and inflammatory cells in BALF in mice among groups (±s, n=10)

表1 各组小鼠气道酚红排泄量、BALF中BDNF含量及炎性细胞数量比较(±s, n=10)Tab.1 Comparison of the Fritillaria cirrhosa on airway phenol red excretion, BDNF and inflammatory cells in BALF in mice among groups (±s, n=10)

BDNF. 脑源性神经营养因子；BALF. 支气管肺泡灌洗液；OVA. 卵清蛋白；与空白对照组比较，(1)P＜0.05；与OVA模型组比较，(2)P＜0.05；与地塞米松组比较，(3)P＜0.05；与川贝母低剂量组比较，(4)P＜0.05

淋巴细胞数(×104/ml)空白对照组 2.01±0.01 1.02±0.01 57.00±1.16 1.02±0.58 3.50±0.21 4.52±0.21 OVA模型组 0.47±0.02(1) 2.74±0.03(1) 125.67±2.60(1) 66.12±1.55(1) 12.81±0.17(1) 15.47±0.20(1)地塞米松组 2.07±0.02(2) 1.21±0.04(2) 87.01±2.31(2) 35.18±1.16(2) 4.80±0.23(2) 8.47±0.18(2)川贝母低剂量组 1.53±0.03(1)(2)(3) 2.01±0.05(1)(2)(3) 109.33±3.48(1)(2)(3) 58.67±0.88(1)(2)(3) 10.37±0.23(1)(2)(3) 12.37±0.23(1)(2)(3)川贝母中剂量组 1.77±0.03(1)(2)(3) 1.79±0.03(1)(2)(3)(4) 97.33±1.76(1)(2)(3) 45.66±2.03(1)(2)(3)(4) 6.97±0.20(1)(2)(3)(4) 9.82±0.07(1)(2)(3)(4)川贝母高剂量组 2.06±0.02(2)(4) 1.30±0.04(2)(4) 86.03±2.11(1)(2)(4) 31.67±1.20(1)(2)(4) 5.53±0.15(2)(4) 8.36±0.05(1)(2)(4)组别 酚红排泄量(mg/kg) BDNF(ng/ml) 炎性细胞总数(×104/ml)嗜酸性细胞数(×102/ml)中性粒细胞数(×104/ml)

2.3 川贝母对OVA小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α浓度的影响 ELISA检测结果显示，与空白对照组比较，OVA模型组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α浓度明显升高(P＜0.05)，而IFN-γ浓度及IFN-γ/IL-4比值(反映Th1/Th2平衡)明显降低(P＜0.05)；与OVA模型组比较，川贝母低、中、高剂量组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13和TNF-α浓度均明显降低(P＜0.05)，而IFN-γ浓度和IFN-γ/IL-4比值明显升高(P＜0.05)；与地塞米松组比较，川贝母高剂量组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ浓度及IFN-γ/IL-4比值无明显变化(P>0.05)；与川贝母低剂量组比较，川贝母中、高剂量组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13浓度明显降低(P＜0.05)，而IFN-γ浓度及IFN-γ/IL-4比值明显升高(P＜0.05)(表2)。

表2 各组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α、INF-γ浓度比较(±s, n=10)Tab.2 Comparison of the serum levels of IgE, IL-4, IL-13, TNF-α and INF-γ of mice among groups (±s, n=10)

表2 各组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α、INF-γ浓度比较(±s, n=10)Tab.2 Comparison of the serum levels of IgE, IL-4, IL-13, TNF-α and INF-γ of mice among groups (±s, n=10)

IgE. 免疫球蛋白E；IL-4. 白细胞介素-4；TNF-α. 肿瘤坏死因子-α；IFN-γ. γ干扰素；OVA. 卵清蛋白；与空白对照组比较，(1)P＜0.05；与OVA模型组比较，(2)P＜0.05；与地塞米松组比较，(3)P＜0.05；与川贝母低剂量组比较，(4)P＜0.05

组别 IgE(ng/ml) IL-4(ng/ml) IL-13(ng/ml) TNF-α(pg/ml) IFN-γ(pg/ml) INF-γ/IL-4空白对照组 21.50±0.74 64.47±0.69 8.17±0.35 622.67±6.06 2032.67±16.70 31.54±0.41 OVA模型组 184.93±2.63(1) 115.80±1.91(1) 26.47±0.38(1) 724.18±8.39(1) 1614.33±12.73(1) 13.95±0.34(1)地塞米松组 41.80±1.03(2) 71.82±1.71(2) 14.13±0.66(2) 625.33±3.71(2) 2066.67±19.34(2) 24.30±0.65(2)川贝母低剂量组125.37±1.32(1)(2)(3) 96.23±1.07(1)(2)(3) 22.45±0.54(1)(2)(3) 688.15±2.08(1)(2)(3) 1803.12±24.30(1)(2)(3) 18.74±0.20(1)(2)(3)川贝母中剂量组83.82±1.67(1)(2)(3)(4)89.63±1.35(1)(2)(3)(4)18.13±0.27(1)(2)(3)(4) 668.33±4.63(1)(2)(3) 1885.33±21.49(1)(2)(3)(4)21.04±0.30(1)(2)(3)(4)川贝母高剂量组43.70±0.89(2)(4) 74.72±0.96(2)(4) 14.37±0.63(2)(4) 634.33±4.10(2)(4) 2055.00±12.70(2)(4) 24.27±0.41(2)(4)

2.4 川贝母对OVA小鼠肺组织中JAK3/STAT6信号通路相关mRNA和蛋白表达的影响 RT-qPCR检测结果显示，与空白对照组比较，OVA模型组小鼠肺组织中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相对表达水平明显升高(P＜0.05)；与OVA模型组比较，川贝母低、中、高剂量组小鼠肺组织中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相对表达水平明显降低(P＜0.05)；与地塞米松组比较，川贝母高剂量组小鼠肺组织中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相对表达水平无明显变化(P>0.05)；与川贝母低剂量组比较，川贝母中、高剂量组小鼠肺组织中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相对表达水平明显降低(P＜0.05)(图1A)。

Western blotting检测结果显示，与空白对照组比较，OVA模型组小鼠肺组织中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相对表达水平明显升高(P＜0.05)；与OVA模型组比较，川贝母低、中、高剂量组小鼠肺组织中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相对表达水平明显降低(P＜0.05)；与地塞米松组比较，川贝母高剂量组小鼠肺组织中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)；与川贝母低剂量组比较，川贝母中、高剂量组小鼠肺组织中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相对表达水平明显降低(P＜0.05)(图1B)。

图1 各组小鼠肺组织中JAK3/STAT6信号通路相关mRNA和蛋白相对表达水平比较(n=6)Fig.1 Comparison of the levels of the JAK3/STAT6 pathway related mRNA and protein in lung tissues of mice among groups (n=6)

3 讨 论

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，其被过敏原或其他环境因素激发后，大量肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞被释放，并伴随大量的IL-4、IL-13等炎性因子释放，从而打破Th1/Th2的平衡。研究发现，一些天然中草药及其成分可通过调节Th1/Th2的平衡缓解哮喘病情，例如：马齿苋提取物可增大哮喘模型大鼠BALF中INF-γ/IL-4的比值，改善Th1/Th2平衡和哮喘大鼠的气道反应性[5]；人参皂苷Rh1可通过调节Th1/Th2细胞因子的平衡而缓解OVA诱导的哮喘小鼠的气道重塑和炎症[10]。值得注意的是，有研究发现川贝母止嗽颗粒对哮喘豚鼠模型具有较好的平喘作用[14]。此外，川贝母可明显减轻哮喘模型小鼠的气道炎症，其作用机制可能与抑制细胞外信号调节激酶(ERK/MAPK)通路的激活有关[12]。本研究发现，川贝母给药可增加小鼠气道酚红排泄量，对OVA致敏小鼠具有祛痰效果。不同剂量的川贝母均可降低OVA诱导的哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量及炎性细胞总数，表明川贝母可减轻OVA致敏小鼠支气管哮喘诱发的炎症。此外，川贝母给药明显降低了OVA小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α的浓度，并升高了IFN-γ的浓度和IFN-γ/IL-4比值，表明川贝母可改善OVA致敏支气管哮喘造成的小鼠免疫系统Th1/Th2失衡。

既往研究发现，由过敏原引起的哮喘患者BALF中BDNF水平明显升高[15-17]，表明BDNF参与了哮喘的发病机制。Watanabe等[18]发现，哮喘的严重程度与BDNF升高程度相关。此外，研究发现，BDNF可促进气道平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞外基质沉积，诱导哮喘患者的气道纤维化、气道高反应性和气道重塑[19]。鉴于BDNF在气道中的多效性，其可能是新颖且有吸引力的治疗靶标。本研究发现，与空白对照组比较，OVA模型组小鼠BALF中BDNF含量明显增加，而川贝母给药明显降低了小鼠BALF中BDNF的含量。还有研究发现，调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)/Th17细胞失衡在哮喘的发病机制中起着重要作用[20]。Th17细胞可募集中性粒细胞，间接吸引嗜酸性粒细胞，加剧哮喘发作。本研究发现，川贝母可降低OVA致敏小鼠BALF中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的数量，提示川贝母可能调节哮喘中Treg/Th17细胞的平衡。但川贝母改善小鼠哮喘的作用机制尚不明确，后续须进一步深入研究川贝母对OVA致敏小鼠肺组织中Treg/Th17平衡的影响及机制。

JAK/STAT信号通路由酪氨酸激酶JAK家族和转录因子STAT家族组成，是一种重要的细胞因子信号转导通路[21]。JAK-STAT级联触发过敏性哮喘中细胞因子介导的信号转导[8]。研究发现，Th2细胞合成的炎性介质尤其是IL-13是JAK/STAT6通路的上游刺激因子，可诱导STAT6磷酸化，STAT6磷酸化参与杯状细胞化生，从而导致黏液分泌过多[8-9]。此外，STAT6是产生Th2相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的关键转录因子[9,22]。因此，在哮喘进程中，JAK/STAT6通路与Th1/Th2平衡相关，在诱导气道高反应性和黏液过度分泌中发挥重要作用。值得注意的是，有研究发现，川贝母水提物可上调STAT1和STAT4蛋白的表达，并促进STAT1和STAT4的靶蛋白IL-12与IFN-γ的分泌，从而调节免疫应答，诱导肺癌细胞凋亡[13]。由此推测，川贝母可能通过调节JAK/STAT通路和Th1/Th2平衡而在哮喘中发挥作用。本研究结果显示，川贝母可抑制JAK3/STAT6信号通路的激活，降低JAK3、STAT6、IL-4mRNA水平，以及p-JAK3、p-STAT6、IL-4蛋白水平，从而缓解OVA致敏小鼠的哮喘症状，这为川贝母治疗支气管哮喘提供了理论支持。

综上所述，本研究结果表明，川贝母能够减轻OVA致敏哮喘小鼠的炎症和Th1/Th2失衡，其作用机制可能与抑制JAK3/STAT6信号通路的激活有关，其具体机制有待后续进一步研究探索。