聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕几种病原体的消毒效果

刘惠芬，刘文光，王安皆，王照红，李云芝

(山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002)

我国是世界上最大的蚕茧、蚕丝生产及出口国，茧丝产量和出口量分别占世界总额的70%和80%[1-2]。2019年我国生产的蚕茧量为72.08万t，农民收入292.35亿元，真丝绸商品出口22.31亿美元[3]。以家蚕为基础的蚕丝业是我国许多地区农民增收的支柱型产业，然而致病病毒、真菌和细菌等微生物的危害直接导致10%左右的蚕业生产损失[4-5]。目前针对家蚕病原菌，生产上消毒多用氯制剂和醛制剂，2种药物对环境影响较大，对人体也存在各种危害[6-7]。筛选消毒效果好、用量少、对环境和人体安全的新型蚕用消毒药剂，是建立规模化养蚕安全模式的关键技术措施之一[8]。

聚六亚甲基双胍盐酸盐(polyhexamethylene biguanide hydrochloride，PHMB)是一种环保型高分子聚合物杀菌消毒剂，为无色、无嗅、不燃、不爆的液体，具有杀菌谱广、有效浓度低、作用速度快、性质稳定、易溶于水等优良性能，可在常温下使用，长期抑菌，无腐蚀性[9-11]，杀菌过程中不发生强氧化反应，通过在细胞内产生沉淀作用及细胞内磷的数量上升，阻碍细胞壁与核酸的合成[12-13]，其对蝙蝠蛾幼虫的经口急性毒性，半数致死量大于10 g·L-1，在正常消毒范围内基本没有影响，属于实际无毒级消毒液[14]。聚六亚甲基双胍盐酸盐是一种环保型杀菌消毒剂，具有高效的杀菌效果[15-17]，目前未见其用于家蚕病原体消毒，因此，本研究将探讨聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕主要病原体(病毒、细菌、真菌)的消毒效果及其对蚕茧质量的影响，为开发新型绿色高效蚕用消毒剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

聚六亚甲基双胍盐酸盐为山东优索化工科技有限公司分装的佳和晟世样品，档案编号：079410002090；碳酸钠(Na2CO3)购自天津市标准科技有限公司。

供试家蚕品种为菁松×皓月，由山东广通蚕种集团有限公司提供。蚕卵正常环境下催青孵化，幼虫在24～28 ℃、相对湿度70%左右的条件下桑叶饲育。

供试病原由本所家蚕病理实验室保存。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)、质型多角体病毒(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis viruses，BmCPV)以家蚕继代制取，精制后配成浓度为5.0×107mL-1的悬液，放置4 ℃冰箱中保存备用。家蚕病原白僵菌(Beauveriabassiana)自5龄幼虫接种白僵菌发病死亡的蚕体中分离获取；黄曲霉(Aspergillusflavus)自5龄幼虫接种黄曲霉菌发病死亡的蚕体中分离获取，对以上2种病原真菌取分生孢子加适量吐温-80使其悬浮于灭菌蒸馏水中，经2层纱布过滤，分别稀释至1.0×108mL-1、5.0×107mL-1于4 ℃冰箱中保存备用。取苏芸金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、沙雷铁氏菌(又称灵菌，Serratiamarcescens)的营养琼脂斜面培养物，用少量灭菌水及少量吐温-80洗下，分别稀释至1×108mL-1置于冰箱中4 ℃保存备用。

试验于2020、2021年在山东省蚕业研究所家蚕病理实验室进行。

1.2 对家蚕多角体病毒的消毒试验

将聚六亚甲基双胍盐酸盐配制成质量浓度为400、200、100、50 mg·L-1的复配药液，各取200 μL分别与5.0×107mL-1的BmNPV、BmCPV多角体病毒悬液200 μL混合，混合后聚六亚甲基双胍盐酸盐浓度分别为200、100、50、25 mg·L-1，碳酸钠浓度为5.0 g·L-1，病毒浓度为2.5×107mL-1，30 min后将混合液涂于2 cm×2 cm桑叶正反面，给蚁蚕添食24 h，BmNPV处理组饲养2个龄期、BmCPV处理组饲养3个龄期，调查死亡率。以自来水替代药液处理为毒对照，并设空白对照。

1.3 对家蚕病原白僵菌、黄曲霉菌的消毒试验

将聚六亚甲基双胍盐酸盐配制成质量浓度为800、400、200、100、50 mg·L-1的复配药液，各取200 μL，分别与1.0×108、5.0×107mL-1的白僵菌、黄曲霉菌孢子悬液200 μL混合，混合后聚六亚甲基双胍盐酸盐浓度分别为400、200、100、50、25 mg·L-1，碳酸钠浓度为5.0 g·L-1，白僵菌、黄曲霉孢子悬液浓度分别为5.0×107、2.5×107mL-1，30 min后将混合液涂于蚕体(白僵菌涂于2龄起蚕蚕体、黄曲霉菌涂于蚁蚕蚕体)，保湿饲育24 h后改正常饲育，饲养2个龄期调查死亡率。以自来水替代药液处理为毒对照，并设空白对照。

1.4 对家蚕病原细菌的消毒试验

将配制的1.0×108mL-1苏芸金芽孢杆菌悬液与质量浓度为4 000 mg·L-1的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液等量混合，混合后药物浓度为聚六亚甲基双胍盐酸盐2 000 mg·L-1、碳酸钠5.0 g·L-1；沙雷铁氏菌悬液分别与质量浓度为800、400、200、100、50 mg·L-1的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配溶液等量混合，混合后药物浓度分别为聚六亚甲基双胍盐酸盐400、200、100、50、25 mg·L-1，碳酸钠5.0 g·L-1，混合30 min后，用处理的病原菌菌悬液对5龄起蚕进行皮下穿刺接种，饲养24 h，调查发病率。另设皮下穿刺未处理菌悬液作毒对照和不接菌穿刺作空白对照。

1.5 药液的稳定性试验

不同时间(2、1、0 d)配制含聚六亚甲基双胍盐酸盐400、200、100、50 mg·L-1的复配药液(均含碳酸钠10.0 g·L-1)，将此药液敞口放置于室内，同一时间与5.0×107mL-1的BmNPV、BmCPV等量混合进行消毒，30 min后将混合液涂于2 cm×2 cm桑叶正反面，给蚁蚕添食24 h，BmNPV处理组饲养2个龄期、BmCPV处理组饲养3个龄期调查死亡率。以自来水替代药液处理为毒对照，并设空白对照。

1.6 对茧质影响试验

配制质量浓度为200.0、100.0 mg·L-1的聚六亚甲基双胍盐酸盐消毒液(均含5.0 g·L-1碳酸钠)，4龄1、3 d，5龄1、3、5、7 d添食24 h药液，其余时间饲喂普通桑叶，空白对照组用自来水代替消毒液，上蔟后10 d采茧。每区60头家蚕，每个处理重复3区，在24～25 ℃条件下饲养。调查各区全茧量、茧层量及茧层率等。

1.7 数据统计处理

数据采用SPSS 20.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕病毒的消毒效果

不同浓度聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕病毒的消毒效果表明，50 mg·L-1的聚六亚甲基双胍盐酸盐药液对BmNPV、BmCPV处理组家蚕死亡率分别为12%和4%，100 mg·L-1及以上质量浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐药液对BmNPV、BmCPV处理组家蚕死亡率均为0(表1)，说明含有100 mg·L-1及以上质量浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕BmNPV、BmCPV 2种病毒具有好的消毒效果。

表1 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕病毒的消毒效果

2.2 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕病原真菌的消毒效果

200 mg·L-1及以上质量浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐药液对家蚕白僵菌、黄曲霉菌处理后家蚕死亡率为0(表2)，结果表明聚六亚甲基双胍盐酸盐药液对家蚕白僵菌、曲霉菌2种真菌均具有良好的消毒效果。

表2 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕病原真菌的消毒效果

2.3 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕病原细菌的消毒效果

从表3中可以看出，2 000 mg·L-1聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液处理苏芸金芽孢杆菌30 min无消毒效果。用400、200 mg·L-1的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液处理沙雷铁氏菌30 min，皮下穿刺的家蚕死亡率为0，消毒效果较好。

2.4 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液的稳定性

将配制2、1、0 d的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液同一时间分别与BmNPV、BmCPV等量混合进行消毒，30 min后将混合液涂于桑叶饲蚕，结果表明,复配药液的稳定性较好(表4)，生产上配制100 mg·L-1及以上质量浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液可以2 d使用。

2.5 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对茧质的影响

处理家蚕后调查单粒重、茧层量、茧层率等指标。结果显示，4～5龄饲喂200.0、100.0 mg·L-1的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕全茧量、茧层量、茧层率等指标未见显著影响(表5)。

表3 聚六亚甲基双胍盐酸盐溶液对家蚕病原细菌的消毒效果

表4 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液的稳定性消毒试验

表5 聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对茧质的影响

3 小结与讨论

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和质型多角体病毒(BmCPV)2种病毒多角体外壳均为一层碱溶性蛋白，需碱性环境才能破坏多角体外壳并释放出病毒粒子[18-19]。前期我们研究发现含有碳酸钠的复配药液对家蚕病毒病消毒效果较好[8,20]，因此，本研究配制的聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液在与病原混合后均含5.0 g·L-1碳酸钠。聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液100 mg·L-1对家蚕BmNPV、BmCPV的消毒效果达到100%，200 mg·L-1对家蚕白僵菌、黄曲霉菌的消毒效果为100%，200 mg·L-1对沙雷铁氏菌消毒效果较好。4～5龄隔天添食24 h聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液对家蚕全茧量、茧层量、茧层率未见不良影响，因此，该复配药液不仅可用于蚕室蚕具消毒，还可用于桑叶叶面消毒。由于外界环境影响因素较多，用于蚕室蚕具消毒时，浓度可适当提高，仅用于桑叶叶面消毒时，200 mg·L-1的浓度即可。聚六亚甲基双胍盐酸盐复配药液敞口存放2 d对家蚕多角体病毒仍具有较好的消毒效果，在蚕桑生产中可以放到第二天继续使用，减少浪费。

聚六亚甲基双胍盐酸盐属于环保型高分子聚合物杀菌消毒剂[6]，配合碳酸钠使用，对家蚕茧质无不良影响，且对家蚕主要病原菌的有效消毒浓度可低至200 mg·L-1，用量很少，具有显著的环保优势，对于蚕桑生产中的消毒环节具有重要的意义。