NOD蛋白在浆细胞性乳腺炎患者病变组织中的表达

徐政杰，方 堃，姜苏晓，张 萍

（银川市妇幼保健院外科，银川 750004）

浆细胞性乳腺炎（plasma cell mastitis，PCM）是一种特殊的乳腺炎，易被误诊为炎症性乳腺癌[1-2]。PCM好发于非哺乳期的年轻女性，常表现为乳头后腔肿块，乳头和分泌物倒置。最常见的并发症是乳腺瘘[3]。手术切除是有效的治疗方法[4]。如治疗不及时或手术切除不彻底，可能导致全乳房切除，还可能罹患抑郁症甚至威胁患者生命。因此探索合适的检测指标具有重要的研究意义[5]。核苷酸寡聚化结构域受体（NOD）1和NOD2蛋白是核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族两个主要成员，与其配体结合后可以激活下游的受体相互作用蛋白2（RIP2），继而引起炎性反应[6]。有研究[7]发现，NOD与多种疾病的发生密切相关，NOD样蛋白的激活最终导致Caspase-1通路半胱氨酸天冬氨酸酶激活介导的炎性反应。而NOD1、NOD2蛋白与PCM发病之间的联系尚未见文献报道，本研究主要通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）法检测PCM病灶组织和正常组织中NOD1、NOD2的mRNA和蛋白水平的变化，探讨NOD1、NOD2蛋白与PCM的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择银川市妇幼保健院2018年1月至2020年1月收治入住的26例PCM患者资料，均为经产妇，产后1.5～6.0年发病，年龄23～36岁，平均年龄（26.15±5.21）岁，病程1～12个月；其中双侧PCM 1例（4%），左侧PCM 9例（35%），右侧PCM 16例（61%）。收集患者的病变组织样本，同时采集炎性肿块组织样本及距离炎性肿块边缘≥3 cm且镜检为正常乳腺组织的样本。所有组织标本经手术切除后立即无菌操作于磷酸盐缓冲液（PBS）冲净后放入5 mL的EP管中，标记好后放入液氮罐中暂存，并迅速转移保存于-80℃低温冰箱中备用。

1.2 纳入与排除标准[8-10]

纳入标准：1）患者均经皮组织病理活检确诊为PCM；2）不同程度地存在乳房肿块，细菌培养结果提示阴性；3）均知情同意。排除标准：1）有恶性肿瘤者；2）有自身免疫性疾病者；3）有肝肾功能障碍或伴有其他系统疾病者；4）有血液疾病者。

1.3 qRT-PCR实验

提取PCM患者乳腺炎性肿块组织（PCM组）和距离炎性肿块边缘≥3 cm且镜检为正常乳腺组织（正常乳腺组）的总RNA后，按照逆转录试剂盒说明，将1 000 ng的RNA逆转录成cDNA，稀释10倍后用DNA荧光染料（SYBR Green）法检测mRNA的表达量。选取GAPDH作为内参基因，在CFX Manger软件系统中，采用2－ΔΔCt法分析基因的相对表达量。每个样本设3个复孔，实验重复3次，引物序列见表1，该引物由上海生工生物工程有限公司合成。RNAiso Plus、逆转录试剂由大连宝生物工程提供，SYBR Green染料购于瑞士Roche公司。

表1 NOD1、NOD2引物序列

1.4 Western blot实验

采用含苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（PMSF∶RIPA=1∶100）提取冻存的PCM炎性肿块组织及正常乳腺组织的总蛋白，用蛋白质定量（BCA）法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离总蛋白，然后利用湿转法将蛋白转移到活化的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜2 h。用1×PBST洗膜3次，每次15 min，一抗4℃敷育过夜。用1×PBST洗涤膜，二抗常温下敷育2 h。洗膜，显影，分析条带。Anti-NOD1抗体（1∶1 000，Proteintech，中国），Anti-NOD2抗体（1∶1 000，Proteintech，中国），Anti-β-actin内参抗体（1∶5 000，Proteintech，中国），Mouse源二抗（1∶1 000，Cell Signaling Technology，美国），Rabbit源二抗（1∶1 000，Cell Signaling Technology，美国）。实验结果用软件Image Pro Plus进行处理，并分析组间条带灰度值的差异（蛋白定量分析=目的条带灰度值/内参条带灰度值）。RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜、10×PBST及BCA蛋白定量试剂盒均购于碧云天生物科技有限公司（中国）；ECL化学发光显色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司（中国）；脱脂奶粉购于BD公司（美国）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，相关性分析采用Pearson相关分析，组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCM组与正常乳腺组样本中NOD1和NOD2 mRNA表达及相关性分析

PCM组炎性肿块中NOD1、NOD2 mRNA水平均高于正常乳腺组（P均＜0.05）。Pearson相关分析结果显示NOD1和NOD2 mRNA水平呈正相关（r=0.963 2，P＜0.05），见图1。

图1 PCM患者乳腺炎性组织与正常组织中NOD1、NOD2 mRNA表达及相关性

2.2 PCM及正常乳腺组样本中NOD1和NOD2蛋白表达及相关性分析

以β-actin为内参，PCM组炎性肿块中NOD1、NOD2蛋白均较正常乳腺组升高（P均＜0.01）。Pearson相关分析显示，NOD1蛋白表达水平与NOD2蛋白表达呈正相关（r=0.997 2，P＜0.05），见图2。

图2 PCM组与正常乳腺组中NOD1与NOD2蛋白表达及相关性

3 讨论

PCM是乳腺实质的炎性疾病，其特征是导管周围炎性反应，伴有导管扩张。本病由于缺乏诊断的金标准，主要结合临床表现、组织病理学和辅助检查进行综合分析，在排除乳腺结核和特异性肉芽肿性病变的基础上进行诊断[11]。PCM病因不明，其治疗后复发概率较大且病程长，不恰当和不规则的治疗方式常使PCM患者病情加重，甚至需后期采取根治性病灶措施及乳腺切除术[12]。

目前，有研究[13]表明，NOD1与NOD2蛋白与炎症及免疫性疾病呈正相关，像Toll样受体（Tolllike receptors，TLR）一样，NOD1和NOD2属于免疫系统的模式识别受体（PRR），用于识别多种细菌和病毒抗原，从而通过炎性细胞因子来组织免疫防御。NOD1、NOD2已被证明在牙周炎[14]、特发性皮炎[15-16]、过敏性哮喘[17]、克罗恩病[18]和类风湿关节炎（RA）[19-20]中均有表达，并且NOD1或NOD2的激活产生与TLR协同促炎作用和破坏性介质的作用，能够在RA的慢性和破坏性炎症中发挥重要作用[21-22]。

徐丹丹等[23]在利用金黄色葡萄球菌构建的小鼠乳腺炎模型中发现，随着NOD1、NOD2 mRNA表达升高，其下游RIP2、NF-KB、IL－6及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达水平也升高，表明NOD1、NOD2可能参与金黄色葡萄球菌的识别及下游通路的激活，从而参与乳腺免疫应答。提示NOD1和NOD2蛋白可能在乳腺炎致病过程中发挥作用，但在人乳腺炎中的研究尚未见文献报道。本研究结果显示，NOD1、NOD2 mRNA水平在PCM炎性病灶中较正常乳腺组织中升高；同时在病灶中NOD1、NOD2 mRNA表达水平呈正相关。Western blot检测结果也显示，上述两种蛋白的表达在PCM病灶中较正常乳腺组织升高；而NOD1和NOD2蛋白的表达水平在PCM病灶中亦呈正相关，说明两者在PCM的致病过程中可能共同发挥促炎作用，在一定程度上说明NOD1及NOD2蛋白参与了PCM的发病，为探索新的诊断标记物提供了新的思路，对浆细胞性乳腺炎开展分子靶向治疗具有一定的参考价值。但由于本研究仅从转录及蛋白表达层面对NOD1及NOD2的差异表达及两者相关性进行了检验，有一定局限性。