HPLC法测定通宣理肺片中多指标性成分的含量

李坚李运石晓峰

1.兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050

通宣理肺片收载于《中国药典》，由紫苏叶、前胡、桔梗等11味中药组成，具有解表散寒，宣肺止咳的功效；用于风寒束表、肺气不宣所致的感冒咳嗽等症的治疗[1］。其现行标准项下规定盐酸麻黄碱、枳壳、甘草、紫苏叶等的薄层鉴别及黄芩苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定，对其质量进行控制。近年来，有学者开展了通宣理肺片指纹图谱[2］、柚皮苷含量测定[3］及基于近红外的一致性检验模型[4］等研究工作。为了更全面的掌握、控制通宣理肺片的整体质量，本文结合前期研究基础，选择甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸等6种指标性成分的含量为考察对象，建立了HPLC法同时测定方法，以期为该制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695液相色谱仪（Waters公司）；XSE205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB-800DT超声波恒温清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试剂 甘草苷（批号：111610-201908，纯度：95%）、柚皮苷（批号：110722-201815，纯度：91.7%）、橙皮苷（批号：110721-202019，纯度：95.3%）、新橙皮苷（批号：111857-201804，纯度99.4%）、甘草酸铵（批号：110731-201619，纯度96.2%）对照品，均购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷（批号：8369，纯度：96.2%）对照品购自上海诗丹德生物技术有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯；纯化水为实验室自制。

1.3 试药 收集7个不同厂家生产的28份通宣理肺片样品。见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备。精密称取各对照品适量，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，即得（其中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸的浓度分别为0.928、1.737、0.679、1.778、1.708、0.965mg/mL）。

2.1.2 供试品溶液的制备。取编号为S3的样品适量，研成粉末，取约1g置于150mL锥形瓶中，精密加入70%乙醇25.00mL，称定质量，超声处理（功率300W，频率40kHz）30min，放冷，再次称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备。按照处方比例及工艺，分别模拟制备缺甘草，缺陈皮，缺枳壳，缺陈皮、枳壳，缺黄芩及缺甘草、黄芩、陈皮、枳壳的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件[5］。CAPCELL PAK C 18 MG色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）；0.1%甲酸水溶液（A）-80%乙腈（B），梯度洗脱（0～5min，15%～20%B；5～10min，20%～25%B；10～20min，25%B；20～30min，25%～48%B；30～40min，48%～70%B；40～45min，70%～90%B；45～55min，90%B；55～56min，90%～15%B；56～60min，15%B）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；进样体积：10μL。

2.2.2 系统适用性试验。分别取“2.1”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分析，色谱图见图1。分析结果提示，各指标性成分分离度良好；阴性样品色谱图中，各对应目标化合物在相应的保留时间无色谱峰吸收出现，表明处方中其他共存物质对含量测定结果无干扰，理论塔板数以黄芩苷（5号峰）计应不得少于5000。

图1 通宣理肺片及其阴性样品的HPLC色谱图

2.2.3 线性关系考察。精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液适量，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，在“2.2.1”项下色谱条件分析。以对照品质量浓度为横坐标（X，μg/mL），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各指标性成分的线性关系及相关系数

2.2.4 精密度试验。取“2.2.3”项下混合对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下重复进样6次，以色谱峰面积积分值计算相对标准偏差（RSD），结果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、峰面积的RSD（n=6）分别为1.57%、2.47%、2.27%、2.47%、2.32%、2.67%，表明该方法的仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验。取编号为S3的样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件进样测定，测得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸峰面积RSD分别为1.05%、1.09%、2.20%、2.18%、2.52%、1.61%，表明该方法的重复性良好。

2.2.6 稳定性试验。取编号为S3的样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”项色谱条件进样分析，测得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸峰面积RSD分别为1.43%、2.68%、1.40%、1.10%、0.36%、1.11%，表明供试品溶液在24h内均处于稳定状态。

2.2.7 加样回收率实验。精密量取各成分含有量已知的样品（S3）0.5g，共6份，加入对照品溶液，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和甘草酸平均加样回收率（n=6）分别为98.65%、102.10%、98.53%、98.69%、94.12%、99.05%、RSD分别为2.05%、1.68%、2.30%、1.29%、2.25%、1.49%。

2.2.8 样品测定。分别取28批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样分析，计算含量。见表3。

表3 各指标性成分的含量测定结果（%，n=3）

3 讨论

3.1 流动相的考察 本实验考察了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%甲酸、90%乙腈-0.2%磷酸水、80%乙腈-0.2%磷酸水、80%乙腈-0.1%甲酸水等不同流动相系统的分离效果，结果表明以80%乙腈-0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱，各指标成分峰形较好。

3.2 测定波长的考察 采用DAD检测器，对各指标成分进行全波长扫描，比较不同吸收波长处色谱峰响应强度，最终确定250nm作为检测波长，各成分在该波长下，检测灵敏度较好，无干扰。

3.3 含量测定结果分析 28份分析样品中，甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸的含量分别为0.0046%～0.0735%、0.0169%～0.5200%、0.0151%～0.2408%、0.0084%～0.4399%、0.4348%～0.8137%、0.0137%～0.1068%。结果提示，各企业内部不同批次间各指标成分的含量差异较小，一致性较好。而在不同企业间各样本中指标成分的含量差异较大。

综上，本实验建立了同时测定通宣理肺片其中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸含量的HPLC方法，能够较全面地反映该制剂的产品质量状况；且测定方法简便易行、稳定性好，可为该制剂的整体质量控制提供参考。