远隔缺血后适应治疗联合阿替普酶对脑梗死患者miR-199a、miR-137表达的影响

丁文婷 王心颖 高倩 魏琰 崔永健

(衡水市人民医院神经内科，河北 衡水 053000)

脑梗死是一种常见的脑血管疾病，指的是脑部血液循环出现障碍，缺氧、缺血所导致的局限性的脑组织的软化及缺血性坏死，患者常会出现偏瘫、呕吐、感觉障碍等症状〔1〕。发病的部位在颅脑、头部，主要病因是心源性栓塞、大动脉粥样硬化及小动脉闭塞，平时可以通过控制血压、血脂及血糖的方法来预防此病的发生〔2〕。研究表明，miR-199a、miR-137的高表达与脑梗死的发生发展有着密切的联系〔3，4〕。远隔缺血后适应治疗指的是对人体组织的器官进行非致死及短暂的缺血后，维持缺血的过程，并提高机体对缺血的耐受能力〔5～7〕。阿替普酶为脑梗死的常用治疗药物〔8～11〕。本研究主要探讨远隔缺血后适应治疗联合阿替普酶对脑梗死患者miR-199a、miR-137表达的影响。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年6月至2019年6月衡水市人民医院收治的脑梗死患者158例，按照完全随机法分为阿替普酶组和适应联合组各79例。阿替普酶组男40例，女39例，病程：Ⅱ期：42例，Ⅲ期：37例；年龄60～75岁，平均年龄(64.12±7.13)岁，适应联合组男41例，女38例，病程：Ⅱ期：43例，Ⅲ期：36例；年龄60～76岁，平均年龄(64.60±7.60)岁，两组年龄、性别、病程差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，研究对象及家属均签署了知情同意书。纳入标准：均为脑梗死患者，同时伴有偏瘫、脑部血液循环障碍、感觉障碍等症状。排除标准：合并脑外伤、免疫系统出现障碍、脑部肿瘤、再发脑梗死、合并脑出血、药物过敏。药物来源：阿替普酶(BoehringerIngelheim Pharma Gmb H & Co.KG，国药准字：S20160054)，规格：20 mg×1支/盒。

1.2方法

1.2.1治疗方法 阿替普酶组使用阿替普酶治疗：剂量为0.9 mg/kg，最大剂量为90 mg，将阿替普酶与100 ml的生理盐水混合，将总剂量的10%在2 min内进行静脉注射，将剩余的90%注射液在60 min内给予静脉滴注治疗，在滴注后的24 h内避免使用抗凝药物及抗血小板药物，连续治疗2 w。适应联合组采用远隔缺血后适应治疗联合阿替普酶治疗：血压计袖带压迫一侧的肱动脉充气直至缺血5 min，接着放气后再灌注5 min，重复3个放气松气的循环，接着在另一侧的上肢致患者缺血5 min，接着再放气灌注5 min，一直重复3个循环，2次1 d，治疗7 d，阿替普酶用法用量同阿替普酶组。

1.2.2神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、超敏C反应蛋白(hsCRP)检测 抽取所有研究对象清晨空腹静脉血5 ml，以离心半径5 cm、3 000 r/min进行离心处理10 min，分离上层血清，在-49℃保存待检备用。采用酶联吸附试验检测NSE、NGF、BDNF、hsCRP，制作标准品，以1∶2的稀释液稀释样品；在反应孔中加入已稀释的标准品100 μl/孔，在37℃恒温孵育箱中湿育2 h；用洗涤液将反应板洗3次后，加入1∶100倍稀释后的抗体工作液100 μl/孔，放于37℃恒温孵育箱中湿育47.19 min；继续清洗反应板2次后，在反应孔内加入3，3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液100 μl/孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育47.19 min后在反应孔内加入终止液100 μl/孔终止反应，在451 nm波长测定吸光度，颜色反应深浅与NSE、NGF、BDNF、hsCRP呈正比，绘制标准曲线计算NSE、NGF、BDNF、hsCRP。

1.2.3同型半胱氨酸(Hcy)、纤维蛋白原(FIB)水平检测 采用化学发光法检测Hcy、FIB；将取出的Hcy、FIB血清制成抗体后加入发光物质的抗体里，等待血清Hcy、FIB抗体和发光物质抗体发生反应后，立刻洗去多余标记物后加入氧化反应体系里，测定发光强度，将测定出来的发光强度换算成对应的被检测物的数据，即可得出Hcy、FIB的检测结果。

1.2.4miR-199a、miR-137表达量检测 采用荧光定量PCR检测所有研究对象miR-199a、miR-137表达量。反应体系：8 μl cDNA模板、10 μl SYBRP Green mix、2 μl PCR Primer mix。反应条件：95℃ 10 min；95℃ 10 s；60℃ 1 min；40个循环。以U6为内参，采用2-△△Ct方法计算miR-199a、miR-137表达量。内参引物序列：5′-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游：5′-GAGGATCTTCATGAGGTA GTCAGT-3′。miR-199a引物序列：上游：5′-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3′，下游：5′-CTGGCA CCACACCTTCTACAATGAGC-3′。miR-137引物序列：上游：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′，下游：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。

1.2.5临床疗效评价 根据患者临床症状评价治疗效果，显效：治疗后大脑缺氧、眩晕、恶心等症状完全消失，不会出现偏瘫的情况。有效：大脑缺氧、眩晕等症状几乎消失，但是偶尔还会出现恶心的症状。无效：治疗后没有得到任何有效的改善，甚至症状及病情比之前更严重。治疗总有效率=(有效例数+显效例数)/总例数×100%。

1.2.6不良反应情况 统计治疗过程中患者食欲不振、癫痫发作、红疹等不良反应情况。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件进行独立样本t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1NSE、NGF、BDNF水平比较 治疗前两组NGF、NSE、BDNF比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后两组NGF、BDNF高于治疗前，NSE低于治疗前，且适应联合组NGF、BDNF高于阿替普酶组，NSE低于阿替普酶组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2Hcy、hsCRP、FIB水平比较 治疗前两组Hcy、hsCRP、FIB水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后两组Hcy、hsCRP、FIB水平低于治疗前，且适应联合组Hcy、hsCRP、FIB水平低于阿替普酶组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表1 两组治疗前后NSE、NGF、BDNF水平比较

表2 两组治疗前后Hcy、hsCRP、FIB水平比较

2.3miR-199a、miR-137水平比较 治疗前两组miR-199a、miR-137差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后两组miR-199a、miR-137低于治疗前，且适应联合组miR-199a、miR-137低于阿替普酶组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 两组治疗前后miR-199a、miR-137水平比较

2.4临床疗效比较 适应联合组治疗总有效率(97.47%，显效58例、有效19例、无效2例)高于阿替普酶组(81.01%,显效47例、有效17例、无效15例)，差异具有统计学意义(χ2=14.140,P<0.001)。

2.5不良反应发生情况比较 适应联合组总不良反应率(3.79%，食欲不振、癫痫发作、红疹各1例)高于阿替普酶组(1.26%，红疹1例)，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

脑梗死是常见的脑血管疾病，可造成神经元的不可逆损伤，导致神经功能损害，因此脑梗死治疗的重点与难点是寻找有效改善神经功能的治疗手段。缺血后适应的概念最早源于低氧预适应，目前该方法已作为一种新型治疗手段在器官移植、心脑血管病等领域得到运用，并取得了确实可靠的临床疗效〔11〕。但是对患病器官开展原位缺血预适应治疗容易引起靶器官损伤，且难度较大，作为常规治疗无法得到推广，远隔缺血预适应治疗则是运用于上肢的相对安全的缺血预适应，并能够有效改善脑及心脏等器官对缺血损伤的耐受性〔12〕。远隔缺血预适应治疗用于脑梗死的保护脑组织及耐受缺血损伤作用的主要原理在于，通过向上肢局部施加压力，导致肢体局部缺血缺氧，机体适应缺血缺氧状态，并通过神经、体液及全身反应性调节，调动内源性保护因子，从多角度、多靶点抵御脑组织缺血性损伤〔13〕。阿替普酶属于第二代溶栓药物，溶栓时间较尿激酶更短，溶解血栓后在脑梗死治疗中临床表现为神经功能改善〔14〕。本研究提示，远隔缺血预适应联合阿替普酶治疗在神经功能改善方面发挥了协同作用。

BDNF、NGF均是人体神经营养家族因子，能够维持神经元生长、分化及损伤后的修复。有研究认为，神经元损伤后BDNF、NGF 表达水平上升能够加快损伤神经元的修复，促进神经功能改善〔15〕。NSE则是脑灰质神经细胞的特异性蛋白质，缺血、缺氧损伤时细胞膜被破坏，NSE大量释放进入脑脊液，被认为是一种神经细胞损伤的标志物〔16〕。本研究结果说明远隔缺血后适应联合阿替普酶治疗相较于单独使用阿替普酶能够促进神经功能改善，这与二者在神经功能改善方面发挥协同作用有关。Hcy与动脉粥样硬化关系密切，高Hcy被认为是脑梗死的独立危险因素，与脑梗死的发生、发展关系密切〔17〕。FIB是参与凝血和止血过程中的重要蛋白纤维蛋白，与脑梗死血栓形成有直接的关联〔18〕。hsCRP是炎症反应的敏感标志物，脑梗死后病灶部位及周围会出现明显的炎症反应，其血清水平与脑梗死严重程度具有正相关关系〔19〕。本研究结果提示，远隔缺血后适应治疗联合阿替普酶治疗在改善脑梗死病情方面效果更佳。

miRNA表达所调控的信号转导通路和炎症性疾病、代谢性疾病、免疫性疾病等疾病可作为基因靶向药物，均说明miRNA不仅与疾病的发生发展相关，还可用于疾病的诊治，miR-199a、miR-137主要来源于病变的组织细胞，与临床预后相关〔20〕。

本研究结果发现在治疗后脑梗死患者miR-199a、miR-137的水平明显降低，说明远隔缺血后适应治疗联合阿替普酶可增强患者身体功能的恢复，提高患者预后感，有良好的治疗效果。

综上所述，远隔缺血后适应治疗联合阿替普酶治疗脑梗死，可显著改善患者神经因子的水平，促进临床症状恢复，对脑梗死有良好的疗效，效果显著。