老年糖尿病足混合细菌感染病原菌分布及与免疫功能的相关性

郑海龙 那涵 陈小盼 蔡舒婷 韩锋 吴海丽

(海南医学院第一附属医院 1内分泌科，海南 海口 570102;2检验科;3皮肤病科)

糖尿病足(DF)是糖尿病(DM)患者最常见、最严重的慢性并发症之一，在我国50岁以上的DM患者中，DF的发病率高达8.1%〔1〕，糖尿病足溃疡(DFU)和糖尿病足感染(DFI)是导致DM患者截肢、死亡的主要原因，根据相关估计数据，全球每20 s就会有1例DFU截肢，总截肢率高达19.03%，DFU患者的年病死率高达14.4%〔2〕，而我国DFU患者的年病死率和截肢率分别为11%和22%〔3〕。细菌感染是影响DFU创面难愈和复发的核心因素，临床就诊的DFU患者几乎全部存在不同程度的足部感染，老年DFI患者因具有合并基础疾病、机体器官功能减退、组织修复和再生能力弱等特点，其治疗难度更高、感染难以有效控制。及时全身性应用广谱抗菌药物是治疗DFI的基础，但在老年患者中治疗效果往往难以令人满意，这与老年DFI患者创面病原菌的复杂性和耐药现象有关，随着第三代头孢菌素等广谱抗菌药物的广泛应用，病原菌耐药现象更加严重〔4〕。混合细菌感染和多药耐药菌(MDROs)检出率升高是DFI病原学特征的重要变化趋势〔5〕，但目前关于DFI混合细菌感染的病原菌分布和相关因素研究结果分歧较多，同时，虽然研究证实了DFI的发生与机体免疫功能下降有关，但混合细菌感染的发生是否也与之相关，学术界仍未达成共识〔6〕，基于此，本研究针对老年DF患者混合细菌感染的病原菌分布及与免疫功能指标的相关性进行了分析，旨在为临床治疗工作提供研究依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2019年10月至2021年3月海南医学院第一附属医院收治的85例老年DFI患者作为研究对象，根据创面样本病原菌分布将其分为混合感染组(36例)和非混合感染组(49例)，两组患者均签署知情同意书，自愿参与本研究，研究方案经医院医学伦理委员会审核通过。纳入标准：DFI的诊断依据《中国糖尿病足诊治指南》〔7〕和国际DF工作组制订的《糖尿病足感染诊断和治疗指南(2019年更新)》〔8〕，患者年龄均大于60岁，Wagner分级均为2～5级，均于入院当日行常规入院检查并采集感染创面样本行细菌培养，住院资料完整。排队标准：合并严重肝肾功能障碍、恶性肿瘤、自身免疫疾病、血液系统疾病、脑卒中、糖尿病急性并发症者；入组前3个月内有高压氧、臭氧及其他创面治疗史者。

1.2观察指标

1.2.1创面病原菌分布及耐药性 于入院后当日应用抗菌药物治疗前首次伤口换药时采集患者的足部创面样本，样本提取液于37℃下恒温培养48～72 h后，采用MA120型微生物鉴定药敏分析系统(珠海美华医疗科技有限公司)对分离菌株进行菌种鉴定，质控菌种为金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、白假丝酵母ATCC90028，质控菌种均购自南京乐诊生物技术有限公司。将合并两种及以上细菌感染判定为混合细菌感染，采用纸片琼脂扩散法对分离菌种进行药物敏感性检测，参照美国临床和实验室标准协会指南〔9〕对药敏结果进行判定，将对三类或三类以上抗菌药物同时耐药的病原菌判定为MDROs。注意事项：创面样本采集过程均严格执行无菌操作，采样试管严格执行灭菌处理，针对浅表溃疡患者以灭菌盐水棉拭子蘸取溃疡底部分泌物或脓液进行采集，注意避免沾染创面周围皮肤；针对深溃疡及足坏疽患者于清创后以探针采集溃疡深部分泌物或脓液，采样后立即送实验室进行检测。

1.2.2临床特征 通过查阅住院病历对两组患者的年龄、性别、DM病程、DFU病程、Wagner分级、抗菌药物应用史及入院当日的空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NEU%)、降钙素原(PCT)、C 反应蛋白(CRP)、踝肱指数(ABI)、经皮氧分压 (TcPO2)等指标进行比较，其中，FBG、血脂指标、CRP的检测采用Cobas 501型全自动血液生化分析仪(瑞士Roche公司)，WBC、NEU%的检测采用 XT-2000i型五分类血液分析仪(日本Sysmex公司)，PCT的检测采用E601电化学发光免疫分析仪(瑞士Roche公司)，HbA1c的检测采用LC-30A型高压液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，ABI的检测方法为测定踝部胫后动脉或胫前动脉及肱动脉的收缩压而后计算其比值，TcPO2的检测采用TCM4 监测系统(丹麦 Radiometer公司)。质控措施为：在开展研究前，针对参与研究者进行质控培训，主要是对于研究对象的纳入排除标准、病史问诊要点、实验室检测标准方法和关键步骤进行培训，要求检测人员在开展研究前认真阅读仪器及试剂盒使用说明书，严格按照说明书步骤进行操作，在提取数据时采用双人分别提取病历进行数据录入，由研究组质控人员对数据进行最终复核和确认。

1.2.3外周血T淋巴细胞亚群 于两组患者入院当日采集外周静脉血样本2 ml，经乙二胺四乙酸抗凝处理后，采用BD Accuri C6 Plus型流式细胞仪(美国BD公司)对血清中的CD3+T淋巴细胞比例、CD4+T淋巴细胞比例、CD8+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值进行检测，试剂盒为仪器配套试剂盒。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验、Fisher确切概率法、Logistic回归分析。

2 结 果

2.1两组创面病原菌分布及耐药性 混合感染组创面中检出病原菌72株，非混合感染组创面中检出病原菌49株，两组创面病原菌分布的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。混合感染组感染类型以金黄色葡萄球菌+大肠埃希菌〔7例(19.44%)〕、表皮葡萄球菌+大肠埃希菌〔6例(16.67%)〕、铜绿假单胞菌+大肠埃希菌〔6例(16.67%)〕占比较多；其余变形杆菌+大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌+肺炎克雷伯菌各4例(11.11%)，金黄色葡萄球菌+鲍氏不动杆菌3例(8.33%)，变形杆菌+粪肠球菌、变形杆菌+摩氏摩根菌、粪肠球菌+摩氏摩根菌各2例(5.56%)。药敏试验结果显示，混合感染组创面中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌中MDROs检出率高于非混合感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 两组创面病原菌分布〔n(%)〕

表2 两组创面病原菌MDROs检出率的比较〔n(%)〕

2.2两组外周血T淋巴细胞亚群比较 混合感染组外周血CD3+T淋巴细胞比例、CD4+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值均低于非混合感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组外周血T淋巴细胞亚群比较

2.3两组临床特征比较 混合感染组DFU病程、抗菌药物治疗史、Wagner分级为4～5级比例、HbA1c水平高于非混合感染组，ABI和TcPO2水平低于非混合感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组临床特征比较

2.4DFI患者混合细菌感染的相关因素分析 将上述有统计学差异的指标作为自变量纳入Logistic多元回归模型进行分析，结果显示，老年DFI混合细菌感染的发生与抗菌药物治疗史、Wagner分级、ABI、TcPO2、CD4+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值具有相关性(P<0.05)，其中，抗菌药物治疗史、Wagner分级为危险因素，ABI、TcPO2、CD4+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值为保护因素。见表5。

表5 老年DFI混合细菌感染相关因素的Logistic多元回归分析

3 讨 论

与非老年DM患者相比较，老年DM患者的血糖波动幅度大、低血糖发生率较高、血糖波动具有性别差异、预后与HbA1c密切相关，上述血糖波动特点导致老年DM患者的氧化应激和炎症反应更加严重，血管内皮细胞功能障碍更加明显，同时，老年DM患者还具有机体器官功能减退、组织修复和再生能力降低等生理变化，常规合并有多种基础慢性代谢疾病，导致其DFU愈合速度明显低于非老年患者，感染程度更加严重，治疗难度更高。本研究结果可见，在老年DFI患者中，混合细菌感染病例的占比较高，超过了40%，这与相关研究〔10〕报道的水平基本一致。本研究报道了大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌是引起DFI的主要病原菌，相关研究〔11〕结果与本研究结果一致，但有研究〔12〕中也得出了差异化的结论，这可能与选取的研究对象在病变程度和抗菌药物应用史方面存在异质性有关。DFI的感染类型比较多样，包括了浅表的蜂窝织炎、皮肤浅表感染性溃疡和深部的软组织脓肿、坏死性筋膜炎、骨髓炎、坏疽等，相关的病原学研究〔13〕结果显示，未接受过抗菌药物治疗的急性DFI通常由葡萄球菌和链球菌引发，在临床实践中针对轻度的局灶性浅表溃疡DFI的经验性抗感染治疗通常是针对金黄色葡萄球菌和链球菌。然而，深部溃疡DFI则多由混合细菌感染所致，病原菌不仅包括革兰阳性球菌，而且包括大肠埃希菌、克雷伯菌、产气肠杆菌、变形杆菌等革兰阴性杆菌和脆弱类杆菌、消化链球菌等厌氧菌，这导致了不同病情患者创面病原菌构成出现了明显的差异，加之相当一部分患者在入院前已接受了全身性或局部抗菌药物治疗，进一步对创面的病原菌分布状态产生影响。通过本研究可见，混合细菌感染DFI患者的主要创面病原菌的MDROs检出率较高，相关研究〔14〕结果显示，DFI的病原学特点主要是两种或两种以上细菌混合感染占比较高和所感染的病原菌对多种抗菌药物耐药性较强，而在过去十年中，DFI病原菌的重要变化趋势是MDROs检出率的增加，其中，最重要的病原菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌，故金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌也是临床上最常见的MDROs菌株。DFI中混合细菌感染和MDROs菌株的出现具有密切的相关性，相关研究〔15〕证实，混合细菌感染是导致DFI患者MDROs感染风险升高的独立危险因素，而MDROs感染进一步提升了抗感染治疗难度，从而导致了创面难愈和DFU复发，最终提升了患者的截肢和死亡风险。这提示了临床医生在DFI治疗中应注意进行创面病原学的分离和鉴定，对于混合细菌感染患者应高度警惕MDROs感染的发生，在临床治疗中尽量依据药敏试验结果选取敏感性抗菌药物开展抗感染治疗。

通过本研究结果可见，除抗感染治疗史外，DFU病情、末梢血管灌注和供氧情况、机体免疫功能均可对DFI混合细菌感染风险产生影响。在本研究选取的观察指标中，Wagner分级是学术界公认的反映DFU病变程度的可靠指标，相关研究〔16〕结果显示，随着DFU病变程度的加重，不仅病原菌中革兰阴性杆菌的感染率升高，而且混合细菌感染概率和病原菌耐药性也会显著提升，MRSA、产ESBLs革兰阴性肠杆菌等MDROs菌株的检出率也随之增加。ABI是一种简便易行、无创血管灌注评价方法，已被用于冠心病、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、2型糖尿病、肾功能不全等疾病的诊断和评价之中，相关研究〔17〕证实，随着ABI的降低，DFI患者的下肢缺血程度加重，患者细菌感染程度与ABI呈负相关关系。TcPO2能够直接反映皮肤组织细胞的氧合状态，从而提示局部血液循环情况，而DFI病变的直接原因是下肢皮肤微循环功能障碍导致皮肤氧供应减少，故TcPO2可用于准确评价DFI病变局部末梢的缺血缺氧程度，相关研究〔18〕结果显示，DFI患肢足背ABI和动脉血流量与TcPO2水平均呈正相关关系，并可预测DFU创面的细菌清除效果和远期愈合情况。上述三个指标能够综合性反映DFU的宏观病情和末梢组织灌注状态，DFU病情的加重一般会导致创面加深和局部细菌清除能力的下降，最终通过影响创面病原菌的分析提升了混合细菌感染的发生率。本研究结果提示DFI患者机体免疫功能的下降与混合细菌感染风险有关，其原因可能包括以下方面：①DFI患者的免疫功能下降可加重病原微生物的感染程度和深部感染风险〔19〕，从而提升了混合细菌感染风险；②DFI患者机体免疫功能的下降可引起血清促炎因子的反应性过表达和皮质醇水平的升高，而全身性炎症反应的加重进一步促进了免疫内环境紊乱、血管内皮功能损害、凝血功能障碍等病理改变〔20〕，从而导致了机体对病原菌的防御和清除下降，最终提升了混合细菌感染风险；③在DFU的病理过程中，病灶局部存在着由肥大细胞、自然杀伤细胞、CD8+T细胞、单核细胞等参与的免疫调节和主动角化过程〔21〕，而免疫细胞水平的降低可影响皮肤局部的免疫调节能力，从而造成再上皮化障碍、影响创面的愈合过程、提升混合细菌感染的风险。这提示了临床医生应对DFI患者的病情状态和免疫功能进行全面的评价，并积极采取干预措施，努力纠正免疫功能失衡和血管灌注障碍，从而达到降低混合细菌感染率、加速创面病原菌清除、促进创面愈合的目的。

由于患者的临床资料有限，本研究未对负压吸引等局部治疗因素及抗菌药物种类等因素进行研究，也未对患者的肝肾功能、其他慢性并发症情况进行分析，这是不足之处。