糖尿病肾病患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表达与氧化应激水平及TGF-β1/p38MAPK通路的关系

张玉静 刘倩

(邢台市人民医院肾内科，河北 邢台 054000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的一种重要微血管病变，其发病率占DM的30%～35%，同时也是导致终末期肾病的一个主要原因〔1〕。由于DN呈渐进式缓慢发展，患者起病较为隐匿，加之目前由于临床诊断手段的局限性，给患者的早期诊断及治疗带来了阻碍〔2〕。目前研究显示〔3〕，长链非编码RNA(LncRNA)异常表达在多种疾病发生发展过程中扮演重要角色。LncRNA作为一类长度超过200个核苷酸的功能性RNA，可在多水平调控机体基因表达，从而发挥相应的调控作用〔4〕。研究显示〔5〕，LncRNA的表达调控与多种内分泌及代谢疾病密切相关。本研究探讨DN患者外周血LncRNA电压门控钾通道亚家族Q1重叠转录物(KCNQ1OT)1表达与氧化应激水平及转化生长因子(TGF)-β1/p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2017年3月至2019年12月邢台市人民医院收治的2型糖尿病(T2DM)患者162例，其中T2DM合并DN患者75例作为DN组，其余单纯T2DM患者87例作为DM组。此外，选择同期医院健康体检人员80例作为对照组。3组受试者性别、年龄、收缩压、舒张压、体重指数(BMI)比较差异无统计学意义(P>0.05)，DN组与DM组DM病程比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。研究经医院伦理委员会批准同意。

1.2纳入标准与排除标准 纳入标准：①T2DM诊断符合世界卫生组织(WHO)T2DM相关诊断标准；②DN符合《内科学》相关诊断标准〔6〕；③受试者自愿签署知情同意书。排除标准：①合并恶性肿瘤、心血管疾病、肝损伤及其他肾脏疾病者；②合并原发性高血压；③合并严重认知功能障碍者；④合并外伤、感染及自身免疫性疾病者；⑤继发性DM患者。

表1 3组临床资料比较

1.3LncRNA KCNQ1OT1、TGF-β1、P38MAPK、半胱天冬酶(Caspase)-3 mRNA检测 抽取各组受试者清晨空腹静脉血，应用Trizol(美国Invitrogen公司)试剂提取血清中总RNA。提取外周血RNA，参照AMV逆转录试剂盒将其反转录成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以cDNA为模板，进行qRT-PCR。根据目标基因设计合成上下游引物进行PCR扩增，以GAPDH作为内参基因，引物序列：LncRNA KCNQ1OT1上游引物：5′-CCCAGAAAT CCACACCTCGG-3′，下游引物：5′-TCCTCAGEGAGCAGATGGAGA-3′；TGF-β1上游引物：5′-CGCGAG CTGTCAATTGACTT-3′，下游引物：5′-TCGACTGCAC TTGCAGGTGC-3′；P38MAPK上游引物：5′-GCTTGTT TCCTGGTACAGACC-3′，下游引物：5′-CAGTTTCT CTTGGTCAAGGG-3′；Caspase-3上游引物：5′-ATGGACAACTTGGAAACCTCCGTG-3′，下游引物：5′-CC ACTCCCAGTCAAACCTTTAGTG-3′；GAPDH上游引物：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物：5′-GTCCACCACCCGATTGCTGTAG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40个循环。以2-△△Ct值表达各目的基因相对表达量。

1.4氧化应激指标检测 抽取各组受试者空腹静脉血，4 000 r/min离心10 min分离血清，然后置于-20℃冰箱内保存待测。采用分光光度计检测血清超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)活性。采用比色法检测血清活性氧(ROS)，检测严格参照试剂盒使用说明书进行。

1.5统计学分析 采用统计学软件SPSS22.0进行方差分析、t检验、秩和检验、χ2检验、受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结 果

2.13组外周血LncRNA KCNQ1OT1表达比较 DN组和DM组外周血LncRNA KCNQ1OT1相对表达量显著高于对照组(4.585±1.470、3.227±1.027、1.974±0.602，P<0.05)，其中DN组外周血LncRNA KCNQ1OT1相对表达量显著高于DM组(P<0.05)。

2.23组外周血TGF-β1、p38MAPK及Caspase-3 mRNA表达比较 DN组和DM组外周血TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，其中DN组外周血TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA相对表达量显著高于DM组(P<0.05)，见表2。

表2 3组外周血TGF-β1、p38MAPK及Caspase-3 mRNA表达比较

2.33组血清氧化应激指标比较 DN组和DM组血清MDA、ROS显著高于对照组(P<0.05)，SOD显著低于对照组(P<0.05)，其中DN组血清MDA、ROS显著高于DM组(P<0.05)，DN组血清SOD显著低于DM组(P<0.05)，见表3。

表3 3组血清氧化应激指标比较

2.4LncRNA KCNQ1OT1表达与TGF-β1/p38MAPK通路相关性 DN患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表达与TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA、MDA、ROS呈显著正相关(P<0.05)，外周血LncRNA KCNQ1OT1表达与SOD呈显著负相关(P<0.05)，见图1。

图1 DN患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表达与TGF-β1/p38MAPK通路相关性

2.5ROC曲线分析LncRNA KCNQ1OT1对DN的诊断价值 T2DM患者中LncRNA KCNQ1OT1对DN的诊断价值ROC曲线下面积为0.875，见图2。

图2 ROC曲线分析LncRNA KCNQ1OT1对DN的诊断价值

3 讨 论

DN的发生及发展主要原因与长期血糖控制不佳而导致的肾单位局部氧化应激损伤等有关，尤其在具有相关高危因素的人群当中具有更高的DN发生率〔7〕。目前临床上对于DN患者的总体治疗有效率较低，虽然可在短期内抑制患者肾功能的恶化，但患者治疗后病情复发率仍较高〔8〕。因此对于DN发病机制过程中相关生物学因子的研究，可揭示疾病发病原因提供相应的理论基础，从而也为DN的治疗，尤其是免疫及生物学靶向治疗提供相应的依据〔9〕。

LncRNA KCNQ1OT1是一个位于KCNQ1位点上的长链非编码RNA基因，近年来研究显示，印迹基因的异常表达可引发伴有复发突变和表型缺陷的多种人类疾病，同时印迹基因的异常表达与恶性肿瘤的发生发展有关，也与机体炎症及血管相关性疾病有关〔10〕。本研究结果与相关研究报道结果相似〔11〕，LncRNA KCNQ1OT1在T2DM及DN的发生发展进程中发挥着重要作用。本研究ROC曲线提示T2DM患者外周血LncRNA KCNQ1OT1对DN具有良好的诊断价值。

DN发生时，高血糖及代谢紊乱所产生的糖基化终末产物可导致患者机体处于氧化应激状态之下，从而引发肾脏局部炎症、肾脏血流动力学的改变，进而促进各种细胞因子的大量释放，最终可导致细胞外基质的增多，引发肾小球基底增厚及肾小球硬化〔12，13〕。目前研究显示〔14，15〕，TGF-β1高表达与多种原因所引起的肾小球硬化及肾脏纤维化具有密切联系。且近年来研究显示〔16,17〕，TGF-β1介导的足细胞损伤在DN蛋白尿发生、发展及肾小球硬化过程中发挥重要作用，其中肾脏氧化应激是导致足细胞凋亡的一种主要原因，而TGF-β1及Caspase-3是氧化应激所导致足细胞损伤凋亡的重要细胞因子。而p38MAPK作为信号转导通路的交汇点，能够被多种细胞外刺激所活化，从而对细胞的增殖、生长及分化发生相应的调控作用，可介导TGF-β1诱发的系膜区基质沉积〔18〕。此外，氧化应激所诱导的p38MAPK激活可进一步促进细胞凋亡因子Caspase-3引起的足细胞凋亡〔19〕。本研究结果与相关研究结果相似〔20〕，DN患者LncRNA KCNQ1OT1的异常表达与TGF-β1/p38MAPK信号转导通路的激活有关。

有研究提出〔21〕，机体氧化应激反应的增强将导致巨大的损害，大大加速了DN的病程进展。在DN患者肾组织中ROS浓度的升高，过量的ROS将导致肾脏负担，进一步引发氧化应激反应〔22〕。SOD作为一种自由基清除剂，可间接反映机体氧自由基水平；MDA作为一种脂质过氧化物，可反映机体过氧化强度；ROS由线粒体产生，过量的ROS也是导致肾脏损伤的重要因素〔23〕。本研究MDA、ROS、SOD结果与学者研究结果相似〔24〕，提示DN患者存在明显的氧化应激，氧化应激损伤可能是导致DN进展的重要原因，DN患者LncRNA KCNQ1OT1表达与MDA、ROS呈显著正相关关系(P<0.05)，与SOD呈显著负相关关系(P<0.05)。进一步提示糖尿病肾病患者LncRNA KCNQ1OT1的异常表达与机体的氧化应激状态有关。

由于本研究纳入样本量较小，且DN疾病发展机制较为复杂，受多通路多基因调控的影响，进一步研究还需要扩大样本量，并进行进一步深入研究分析。

综上所述，DN患者可出现外周血LncRNA KCNQ1OT1异常表达，且其表达情况与患者氧化应激水平及TGF-β1/p38MAPK信号转导通路激活有关，LncRNA KCNQ1OT1对DN具有良好的诊断价值。