PP2A激活剂对星形胶质细胞迁移能力促进及相关机制

张黎军 赵盼盼 徐志秀 王凡 王朔 任静 袁彬 吉四辈

(新乡医学院第一附属医院神经内科二病区，河南 卫辉 453100)

阿尔茨海默病(AD)是老年常见的因中枢神经系统退行性病变导致的慢性痴呆类型疾病，主要的临床表现有失语失认、记忆障碍、视空间能力损害、计算力损害及人格和行为改变等〔1,2〕。AD常发生于65岁以上的老年人群，在我国每100万人中有3～7万AD患者，发病患者多为女性，在我国每年约有将近700万AD患者，发病率较高，且随年龄的增长患AD概率增加，且85岁后AD的患病率可高达30%〔3,4〕。在AD患者脑内的老年斑周围存在大量的星形胶质细胞聚集〔5〕。本文研究星形胶质细胞的迁移对AD的发病机制及其治疗的作用。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选取10只48 h内的SD级乳鼠，雄雌各一半，由普莱柯生物工程有限公司提供(动物许可证号：SYXK(豫)2020-0002)，体重263～318 g，平均体重(290.50±13.75)g。本实验经医院伦理委员会批准。主要试剂：磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤液购于上海康朗生物科技有限公司；DMEM/F12培养基购于上海研谨生物科技有限公司；蛋白磷酸酶(PP)2A活性检测试剂盒购于上海哈灵生物科技有限公司；钙外液购于北京百奥莱博科技有限公司；Transwell小室购于康宁生命科学(吴江)有限公司；Giemsa染料购于上海谷研实业有限公司；p38、p-p38、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗体购于武汉益普生物科技有限公司。

1.2星形胶质细胞模型建立 酒精消毒后将乳鼠断颈处死，迅速取出其整个大脑并放置在平皿中，使用PBS洗涤至洗涤液透亮后取出大脑的皮层组织并剥离血管膜，剪碎皮层组织加入0.125%胰蛋白酶放置在37℃消化15 min并每隔3 min摇晃1次，待组织完全消化后，加入含有10%胎牛血清、100 U/ml双抗的DMEM/F12细胞培养液终止消化并过筛后离心10 min，加入适量的细胞培养液悬浮细胞，接种到细胞培养瓶中放置在37℃摇床上培养过夜；将分离培养的细胞到96孔板通过免疫荧光实验检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，对细胞进行固定：使用PBS清洗后将4%多聚甲醛分别加入每孔中并固定15～20 min，细胞透膜，使用PBS漂洗后在每孔分别加入0.2% 100 μl TritonX-100，室温透膜15 min，对细胞进行封闭，使用PBS漂洗后加入3% 100 μl牛血清白蛋白室温封闭30 min后加入一抗：将1% 100 μl BSA 1∶2 000稀释的GFAP放置在4℃环境下过夜孵育，随后加入使用PBS缓冲液稀释的二抗山羊抗兔IgG H&L并放置在室温避光环境下孵育1～2 h，将二抗洗丢后使用激光共聚焦显微镜拍照观察，符合星形胶质细胞的特征，鉴定为星形胶质细胞；更换新鲜培养液，培养至第2代时进行后续实验。

1.3分组 将星胶质细胞按实验要求分为对照组、抑制组和激活组，1×105个/ml为细胞浓度，并在抑制组和激活组分别添加15 nmol/L PP2A抑制剂广谱基质金属蛋白酶抑制剂(DES)、激活剂大鼠骨激活素(OA)，在对照组中添加等量二甲基亚砜(DMSO)，将各组细胞均放置在37℃环境下培养。

1.4PP2A酶活性检测 在各组细胞中加入放射免疫沉淀试验(RIPA)细胞裂解液并放置在冰上裂解20 min，将裂解液转移到EP管中4℃离心10 min(15 000 r/min)，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒检测提取蛋白浓度，取50 μg蛋白样品，按照PP2A活性检测试剂盒检测样品中PP2A活性，并根据标准品的浓度及对应的OD值，计算样品中PP2A活性，实验重复3次，取均值。

1.5各组细胞钙离子浓度变化评价 采用钙离子荧光探针技术(Fura-2/AM)检测钙离子浓度变化，将星形胶质细胞传代至玻片且密度在50%；弃去每个培养皿中培养基，使用钙外液清洗3次，每次5 min后在其中加入1 ml钙外液及2 μl Fura-2/AM放置在避光环境下于37℃恒温孵育30 min后再次使用钙外液清洗3次，每次5 min，备用；将玻片放置在实验皿中并使用小砝码将其固定后将实验皿固定在倒置荧光显微镜载物台，将1 ml钙外液加入皿中，使用显微镜观察细胞，并选取好的视野作为检测对象，通过软件选中数个细胞，以340、380 nm分别激发光，实时检测并每秒记录1张ROIs的F340/F380荧光比值图像，以F340/F380的荧光比值间接表示星形胶质细胞内游离钙离子浓度的变化，同一实验取不同批次的细胞重复3次以上。

1.6各组细胞迁移、侵袭能力比较 细胞迁移、侵袭采用Transwell小室检测，将星胶质细胞用胰蛋白酶消化并在其中加入1%胎牛血清细胞悬液，再在Transwell小室的上室中加入500 μl细胞悬液并在Transwell小室的下室中加入10% 700 μl胎牛血清细胞培养液后将小室放置在12孔板放置在37℃ 5%CO2培养箱中培养，去除多余的细胞并滤膜后使用甲醛固定5 min于25℃ 使用Giemsa染料染色15 min，8 h后使用显微镜观察细胞迁移、侵袭的数目，实验重复3次，取均值。

1.7各组细胞p38信号通路因子表达量 采用实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)测定各组细胞中p38通路因子表达量,cDNA合成反转录体积20 μl，其中4 μl 总RNA，1 μl(0.5 μg)随机引物、0.5 μl(20 U)RNase、2 μl(10 U)MdNTP、0.8 μl(15 U)M-MLV反转录10×RT缓冲液3 μl，加灭菌DDW至20 μl，42℃水浴1 h，95℃ 5 min灭活M-MLV逆转录，-30℃冻存备用。PCR体系：PCR体积20 μl,其中2 μl 10×缓冲液，2 μl氯化镁(Mgcl2)，2 μl dNTP，2 μl cDNA，2 μl引物，2.5 U Taq DNA多聚酶，灭菌DDW加至20 μl。PCR条件：经95℃预变性10 min；95℃，15 s；60℃，30 s；循环40次。采用2-△△Ct法计算出细胞中p38通路因子p38、p-p38、MMP-2、MMP-9表达量。p38：上游：5′-GAACAAGACCGTCTGGGAGGTGC-3′，下游：5′-TTGGCGTGAATGATGGACTG AAA-3′；p-p38：上游：5′-CCATTATACGCACGACA ACG-3′，下游：5′-CATTCTGACACCGTGTGACC-3′；MMP-2：上游：5′-CAGGACATTGTCTTGATGGCATC GC-3′，下游：5′-TGAAGAAGTAGCTATGACCACCGC C-3′；MMP-9：上游：5′-AAAGGTCGCTCGGATGGTTATC-3′，下游：5′-TACTCTTGCCCAGGAAGACGAA-3′；β-actin：上游：5′-CTGGCATTGTCATGGACTCT-3′，下游：5′-GCGATGATCTTGATCTTCAT-3′。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1各组细胞PP2A活性比较 激活组PP2A活性(135.94±6.82)明显高于对照组(95.36±4.21)，抑制组(43.82±2.07)明显低于对照组；激活组细胞PP2A活性明显高于抑制组(均P<0.05)。

2.2各组细胞钙离子浓度变化比较 激活组(46.27±16.28)细胞钙离子浓度变化幅度明显高于对照组(34.58±11.09)，抑制组(24.16±5.29)细胞钙离子浓度变化幅度明显低于对照组；激活组细胞钙离子浓度变化幅度明显高于抑制组(均P<0.05)。

2.3各组细胞迁移、侵袭能力比较 激活组细胞迁移、侵袭能力明显强于对照组，抑制组细胞迁移、侵袭能力明显弱于对照组(P<0.05)；激活组细胞迁移、侵袭能力明显强于抑制组(P<0.05)。见表1，图1。

表1 各组细胞迁移、侵袭能力比较

图1 各组细胞迁移、侵袭能力(结晶紫染色，×400)

2.4各组细胞p38信号通路因子表达量比较 激活组p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表达量明显低于对照组，抑制组p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表达量明显高于对照组(P<0.05)；激活组p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表达量明显低于抑制组(P<0.05)。见表2。

表2 各组p38信号通路因子表达量比较

3 讨 论

AD受生活方式、环境、基因等多种因素的影响，其中部分基因也可引起此病〔6～8〕。当患者出现注意力难以集中、记忆力或思维能力减退、幻觉、错觉等主要症状，影响正常生活和工作时应及时治疗，患者家属应对其更加照顾，防止患者出现生命危险〔9〕。目前临床上常用药物治疗，包括石杉碱甲、多奈哌齐、卡巴拉汀等可提高脑内乙酰胆碱水平，加强突触传递。PP2A属于多功能性酶，对真核细胞中大部分的磷酸化酶有调节作用，此外，还可调节特定信号通路〔10,11〕。有研究证实PP2A激活剂可有效改善神经损伤。星形胶质细胞广泛存在于哺乳动物脑内，用经典的金属浸镀技术显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起着支持和分隔神经细胞的作用〔12,13〕。

PP2A底物为众多体内的转录因子和蛋白激酶，在大部分果蝇和小鼠的动物模型实验中显示PP2A对细胞的生长发育起着调控作用，还可与其他磷酸化酶和激酶在信号传导的级联反应中相互作用，还对下游信号有调节作用，其中催化亚基活性主要由转录水平磷酸化和甲基化的状态调控〔14～16〕。在谌勤等〔17〕研究中，激活PP2A活性可降低Tau蛋白的磷酸化水平，提高突出相关蛋白表达水平起到修复受损神经元的功能。在黄惠丽等〔18〕的研究中，PP2A与血流动力学和心肌细胞相关，若抑制PP2A活性可有效改善心功能。

p38信号通路是经典信号通路之一，其中p38是丝裂原活化蛋白激酶，在宫颈瘤、卵巢瘤、淋巴瘤等肿瘤中起作用，在细胞凋亡、增殖等生物学行为及细胞周期中呈特异性表达，且在不同肿瘤中所起的作用也各不相同，甚至作用完全相反〔19,20〕。MMP-2由17个外显子组成其基因组且位于16q12.2，大小约为3 416 bp；该基因约含660个氨基酸残基，蛋白质大小约73 882 D，可降解细胞外基质蛋白并传递信号，可作用于非基质蛋白质，还可促进血管收缩MMP-2基因C端非催化片段具备抗血管生成肿瘤等特性〔21〕。MMP-9是以酶原形式从胞内分泌到胞外，通过有机汞制剂反应可具有活性，在体内则可经一系列蛋白酶级联而激活〔22〕。

综上，PP2A激活剂通过下调p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表达量，进而抑制p38信号通路，促进星形胶质细胞迁移。