氧化苦参碱对高果糖喂养小鼠脂肪肝及肝氧化应激的干预作用

章冬梅 吕秀芹 于贤 刘娜 刘可 宋光耀 陈树春 任路平

(河北省人民医院内分泌科，河北 石家庄 050000)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)在一般人群中发病率为17%～33%〔1〕，NAFLD治疗是目前的研究热点。饮食因素是诱发NAFLD的重要因素之一，研究表明果糖过量摄入也是引起NAFLD的重要饮食因素〔2〕。氧化苦参碱具有调节血脂、抗脂质过氧化、抗感染、抗肿瘤等多种药理作用〔3〕。但目前尚缺少关于氧化苦参碱对脂肪肝内氧化应激影响的研究，故本研究通过果糖过量摄入诱导小鼠肝内脂质沉积，探讨氧化苦参碱对脂肪肝和肝氧化应激的干预作用。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物：选取成年雄性C57BL/J6小鼠各36只，体重24～30 g，适应性喂养1 w后，按随机数字表分为对照组、高果糖组和氧化苦参碱组。对照组给予普通饲料；果糖组饲料配方为：果糖34.5%，淀粉34.5%，脂肪9.0%，蛋白21.0%(配方参考研究〔4〕)；氧化苦参碱组喂养4 w后给予药物干预(苦参素胶囊，江苏正大天晴药业股份有限公司)，给药剂量为40 mg/kg；3组每日进食热量基本相等，喂养8 w。

1.2基本生化指标测定 喂养8 w后给予小鼠禁食10 h，于鼠尾取血，分离血清，全自动生化分析仪测定空腹血糖(FPG)和血清谷丙转氨酶(ALT)，用放射免疫法测定空腹胰岛素(FINS)。

1.3肝组织三酰甘油(TG)测定 切取30 mg冻存的小鼠肝组织，加入裂解液1 ml，碾磨组织，匀浆后静置使组织充分裂解，以抽提TG，应用0.6%氯化钠(NaCl)分离水相和有机相，吸取有机相并溶解于100%乙醇500 μl，应用GPO-PAP试剂盒测定TG含量。

1.4肝脏氧化应激指标检测 应用电动组织研磨仪将肝脏组织破碎并匀浆，15 000 r/min离心15 min后取上清，测定肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及细胞中丙二醛(MDA)含量，上述试剂均购于南京建成生物工程研究所。

1.5小鼠肝脏抗氧化应激相关因子蛋白检测 各组随机选6例样本，Western印迹测定小鼠肝脏氧化应激相关因子蛋白表达。具体方法：取小鼠肝脏组织匀浆，应用10倍裂解液提取肝脏组织中总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法检测肝脏样本蛋白含量。每个样本取20 μg蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，经转膜→封闭→一抗孵育(4°C摇床过夜)→二抗孵育(β-actin)→电化学(ECL)发光→显影→定影；用Image J软件分析，得出样本的目的蛋白相对含量。核转录因子(NF)-E2相关因子(NRF)2、β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，细胞色素P450家族(CYP)2E1抗体购自中国Boster，CYP4A蛋白购自美国Abcam。

1.6统计学方法 采用SPSS22软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1喂养8 w后各组基本指标水平比较 喂养8 w后，与对照组比较，高果糖组体重、FPG、FINS水平均显著上升(P<0.05)，与高果糖组比较，氧化苦参碱组体重、FPG、FINS水平均显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2喂养8 w后各组肝脏相关指标水平比较 喂养8 w后，与对照组比较，高果糖组ALT、TG水平均显著上升(P<0.05)，与高果糖组比较，氧化苦参碱组ALT、TG水平均显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3各组肝脏SOD、CAT、MDA水平比较 与对照组比较，高果糖组SOD、CAT水平均显著下降(P<0.05)，与高果糖组比较，氧化苦参碱组SOD、CAT水平均显著上升(P<0.05)；与对照组比较，高果糖组MDA水平均显著上升(P<0.05)，与高果糖组比较，氧化苦参碱组MDA水平均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组基本指标及肝脏相关指标、SOD、CAT 水平及 MDA含量水平比较

2.4各组肝脏抗氧化应激相关蛋白水平比较 与对照组比较，高果糖组NRF2水平均显著下降(P<0.05)，与高果糖组比较，氧化苦参碱组NRF2水平均显著上升(P<0.05)；与对照组比较，高果糖组CYP2E1、CYP4A水平均显著上升(P<0.05)，与高果糖组比较，氧化苦参碱组CYP2E1、CYP4A水平均显著降低(P<0.05)。见图1、表2。

图1 各组肝脏抗氧化应激相关蛋白表达

表2 各组肝脏抗氧化应激相关蛋白水平比较

3 讨 论

NAFLD发生率逐年升高，NAFLD是无症状ALT升高的最主要原因。研究发现富含高果糖的软饮料大量摄入与NAFLD的发生有密切关系，果糖可刺激肝脏脂质从头合成而引起脂肪肝。高果糖喂养啮齿类动物1 w即表现肝细胞内脂肪增加，Armutcu等〔5〕给予雄性Wistar大鼠饲以10%果糖水，10 d后肝脏病理显示微泡性及大泡性脂肪变。NAFLD的发生分为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化及肝癌4个阶段，多数患者长期停留于单纯性脂肪肝阶段，而氧化应激是介导已经发生脂肪变性的肝细胞进一步发生炎症的重要机制〔6〕。氧化应激是指活性氧簇及其代谢产物的产生过多，超过机体对其防御能力，出现促氧化物和抗氧化物之间的失平衡状态。氧化应激状态下，促进脂质过氧化产物生成和多种细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1等介导炎性反应，肝细胞发生炎症、坏死，肝脏出现纤维化反应〔7〕。肝脏抗氧化防御体系主要由抗氧化酶类系统构成，包括CAT和SOD等多种酶类，MDA是活性氧簇对生物膜氧化的主要产物，MDA的大量产生代表着机体抗氧化能力的下降和氧化应激。本研究提示，果糖过量摄入引起了小鼠肝脏抗氧化防御功能的减弱和氧化应激产物的增加。Nrf2是与氧化应激相关高度保守的转录因子，对很多抗氧化应激因子的基因有调控作用〔8〕。CYP2E1 和CYP4A是负责机体氧自由基产生的重要酶类，也是诱导野生型小鼠脂肪肝的重要因子〔9〕，研究发现NAFLD啮齿类动物和人类肝内CYP2E1 和CYP4A的活性和表达均显著升高，并且和脂质过氧化相关〔10〕。本研究结果提示果糖过量摄入通过促进肝脏CYP2E1和CYP4A的蛋白表达增加，造成了氧自由基的增加，引起了肝脏氧化应激的产生。

氧化苦参碱是自苦豆子及苦参根中提取的小分子化学物质，具有逆转各种原因导致的肝损伤，临床上主要应用于慢性病毒性肝炎的治疗。研究发现氧化苦参碱可下调高果糖喂养诱导的大鼠肝内脂质从头合成，从而改善脂肪肝，氧化苦参碱可降低固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c的基因表达，下调脂质从头合成关键酶脂肪酸合成酶(FAS)，并上调线粒体棕榈基转移酶(CPT)-1的表达，从而通过抑制脂质合成和促进线粒体的脂肪酸氧化改善肝内脂质沉积〔11〕。研究发现，氧化苦参碱可通过缓解内质网应激改善肝脏脂质沉积，氧化苦参碱可改善啮齿类动物NAFLD模型的肝内内质网应激，可减低内质网应激非折叠蛋白反应的上游蛋白如胰腺内质网激酶(PERK)、肌醇需要酶(IRE)-1的磷酸化和活化转录因子(ATF)-6的蛋白表达〔12〕。研究发现氧化苦参碱可通过改善氧化应激对脑、心脏、肝脏、胃肠道、血管内皮等多种器官和组织发挥保护作用〔13〕。研究发现氧化苦参碱可通过激活NRF2通路改善氧化应激，从而治疗脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤〔14〕。本研究结果提示氧化苦参碱对NAFLD的保护作用与改善肝脏不平衡的氧化应激状态有关，氧化苦参碱通过改善氧化应激可逆转高果糖饮食诱导的小鼠NAFLD的病程进展。