circ-RAD23B通过miR-708-5p/CPNE1轴调控膀胱癌细胞增殖、细胞周期、凋亡的机制

郑宏 曾振华 唐建生 王栋洋 李卿

(湘南学院附属医院泌尿外科，湖南 郴州 423000)

膀胱癌是全球常见的癌症，靶向治疗为一种疗效确切且患者耐受性较好的新型治疗模式，已在包括膀胱癌在内的多种实体恶性肿瘤的治疗中有所应用〔1,2〕。研究表明circRNA可能在肿瘤发生、发展等方面发挥着重要调控作用，有望成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶标〔3〕。研究报道circ-RAD23B(circ_0087862)在非小细胞肺癌中过表达，与淋巴结浸润、较低的分化等级和较短的总生存期有关；circ-RAD23B通过miR-593-3p/CCND2轴促进细胞生长，并通过miR-653-5p/淋巴瘤侵袭转移诱导因子(TIAM)1途径促进细胞侵袭〔4〕。circ_0087862下调通过靶向miR-1253/RAB3D轴显著抑制了非小细胞肺癌体内肿瘤的生长，并增加了细胞凋亡〔5〕。然而circ-RAD23B对膀胱癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响及机制尚不清楚。circRNA可作为miRNA海绵吸附miRNA或与RNA相关蛋白结合形成复合物，进而调节基因转录等。研究报道miR-708-5p可能通过靶向细胞增殖上调因子(URGCP)抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭〔6〕。miR-708-5p可靶向GAGE12I抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭〔7〕。LncRNA LOXL1-AS1通过调节miR-708-5p/转录因子(USF)1途径促进胃癌的发生和发展〔8〕。此外，钙离子依赖性磷脂结合蛋白(CPNE)1在三阴性乳腺癌组织和细胞系中过表达，并与患者的肿瘤大小，远处转移和存活率相关；敲低CPNE1可抑制肿瘤生长并促进细胞凋亡〔9〕。CPNE1沉默抑制人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移〔10〕。而miR-708-5p、CPNE1对膀胱癌细胞的影响，两者之间是否有调控作用及circ-RAD23B是否调控miR-708-5p、CPNE1表达也尚不清楚。本实验探讨circ-RAD23B是否通调控miR-708-5p和CPNE1影响膀胱癌细胞的增殖、细胞周期和凋亡。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2017年5月至2019年5月在湖南学院附属医院治疗的49例膀胱癌患者，通过手术切除其癌组织及相应的癌旁组织；所有患者经病理检测确诊为膀胱癌，患者术前未进行过手术及放化疗，患者均知情且同意。

1.2细胞与主要药品试剂 人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1(货号：HUCL-022，上海赛百慷生物技术股份有限公司)；膀胱癌细胞系T24(货号：HT-X1609)、RT4(货号：HT-X1607)、UM-UC-3(货号：HT-X1610，深圳市豪地华拓生物科技有限公司)；RPMI1640培养基(货号：CS-0018LS，上海莼试生物技术有限公司)；荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(货号：XY-TE-0731)、蛋白提取试剂盒(货号：XY-MY-1049)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(货号：XY-MY-0096)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒(货号：XY-MY-0102)(上海烜雅生物科技有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YB11401ES60，上海钰博生物科技有限公司)；噻唑蓝(MTT)试剂盒(货号：BJ-9721)、细胞周期检测试剂盒(货号：BJ-10637，上海邦景实业有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(货号：BL10001-020，上海帛龙生物科技有限公司)。

1.3细胞处理与分组 人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞系T24、RT4、UM-UC-3用RPMI1640培养基培养，取对数生长期T24细胞，将si-NC、si-circ-RAD23B、miR-NC、miR-708-5p、si-CPNE1、pcDNA-NC、pcDNA-CPNE1转染至T24细胞中，分为si-NC组、si-circ-RAD23B组、miR-NC组、miR-708-5p组、si-CPNE1组、pcDNA-NC组、pcDNA-CPNE1组；将si-circ-RAD23B 分别与pcDNA-NC、pcDNA-CPNE1共转染至T24细胞中，分为si-circ-RAD23B+pcDNA-NC组、si-circ-RAD23B+pcDNA-CPNE1组；未转染的正常培养T24细胞为NC组。

1.4实时荧光定量(RT-q)PCR检测circ-RAD23B、miR-708-5p和CPNE1 mRNA表达水平 提取细胞总RNA，反转录成cDNA，按照试剂盒说明进行PCR，循环条件为95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；相对表达量用2-△△Ct法计算。circ-RAD23B和CPNE1以GAPDH为内参，miR-708-5p以U6为内参；引物序列为circ-RAD23B上游：5′-TAGCGGATTCCCTGCTTGTC-3′，下游：5′-GGTGGGGGCTTGTCACATT-3′；CPNE1上游：5′-ACCCACTCTGCGTCCTT-3′，下游：5′-TGGCGTCTTGTTGTCTATG-3′；GAPDH上游：5′-CAGCGACACCC-ACTCCTC-3′，下游：5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′；miR-708-5p上游：5′-GGCGCGAAGGAGCTTACAA-TCTA-3′，下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6上游：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。

1.5Western印迹检测蛋白表达 提取细胞总蛋白后用BCA试剂盒进行定量；然后将蛋白样品进行SDS-PAGE，转至聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育90 min，用电化学发光(ECL)发光液显影，用Quantity One测定蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平为目的条带和β-actin条带灰度值的比值。

1.6双荧光素酶报告实验 构建含有miR-708-5p结合位点的circ-RAD23B和CPNE1的野生型(WT)及突变型(MUT)报告基因载体，将其与miR-708-5p mimics共转染至T24细胞中，按试剂盒说明书检测细胞荧光素酶活性。

1.7MTT检测细胞增殖 收集各组培养48 h细胞，后每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡反应10 min，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(A)值。

1.8流式细胞术检测细胞周期 收集各组培养48 h细胞，制备单细胞悬液，加入预冷的70%乙醇固定，洗涤后加入RNase A，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶(PI)，4℃避光30 min，上机检测激发波长488 nm处红色荧光，用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件对细胞周期进行检测分析。

1.9流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组培养48 h细胞，加入10 μl的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和PI，混匀后避光孵育10 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.10统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1在膀胱癌患者癌组织和癌旁组织中circ-RAD23B表达情况 与癌旁组织(1.00±0.10)比较，膀胱癌组织中circ-RAD23B表达水平(2.46±0.21)明显升高(t=49.939；P<0.05)。

2.2在膀胱癌细胞系中circ-RAD23B、miR-708-5p、CPNE1表达情况 与SV-HUC-1比较，膀胱癌细胞系T24、RT4、UM-UC-3中circ-RAD23B表达及CPNE1 mRNA和蛋白表达水平明显升高，miR-708-5p表达水平明显降低(P<0.05)，见表1，图1。

表1 在膀胱癌细胞系中circ-RAD23B、miR-708-5p、CPNE1表达情况

图1 Western印迹检测CPNE1蛋白表达

2.3circ-RAD23B 靶向miR-708-5p及miR-708-5p靶向CPNE1 Circinteractome预测显示miR-708-5p和circ-RAD23B有结合位点；Targetscan预测显示miR-708-5p和CPNE1结合位点(图2)。miR-708-5p与circ-RAD23B或CPNE1-3′UTR WT报告质粒共转染T24细胞后，细胞荧光素酶活性均降低(P<0.05)；miR-708-5p与circ-RAD23B或CPNE1-3′UTR突变型报告质粒共转染T24细胞后，细胞荧光素酶活性均无显著变化，见表2。

A：circinteractome对miR-708-5p和circ-RAD23B结合进行预测，B：Targetscan对CPNE1和miR-708-5p结合进行预测图2 circ-RAD23B 靶向miR-708-5p及miR-708-5p靶向CPNE1

2.4低表达circ-RAD23B 对膀胱癌细胞T24增殖、细胞周期和凋亡及对miR-708-5p和CPNE1表达水平的影响 与si-NC组比较，si-circ-RAD23B组膀胱癌细胞T24中circ-RAD23B、CPNE1、CyclinD1表达水平及细胞A值、S期细胞所占比例明显降低，miR-708-5p、Cleaved-caspase-3表达水平明显升高，G2/M期细胞所占比例及细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，见表3，图3、4、5。

2.5高表达miR-708-5p对膀胱癌细胞T24增殖、细胞周期和凋亡的影响及对CPNE1表达的影响 与miR-NC组比较，miR-708-5p组膀胱癌细胞T24中miR-708-5p、Cleaved-caspase-3表达水平及G2/M期细胞所占比例、细胞凋亡率明显升高，CPNE1、CyclinD1表达水平及细胞A值、S期细胞所占比例明显降低(均P<0.05)，见图6、7、8，表4。

表2 miR-NC或miR-708-5p与circ-RAD23B和CPNE1-3′UTR WT及MUT报告质粒共转染T24细胞后相对双荧光素酶活性检测结果

表3 低表达circ-RAD23B 对膀胱癌细胞T24增殖、细胞周期和凋亡及对miR-708-5p和CPNE1表达水平的影响

图3 3组细胞凋亡流式图

图4 3组细胞周期流式图

1～3：NC组，si-NC组，si-cire-RAD23B组图5 Western印迹检测3组CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

图6 两组细胞凋亡流式图

图7 两组细胞周期流式图

图8 Western印迹检测两组CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表4 高表达miR-708-5p对膀胱癌细胞T24增殖、细胞周期和凋亡及CPNE1蛋白表达的影响

2.6低表达CPNE1对膀胱癌细胞T24增殖、细胞周期和凋亡的影响 与si-NC组比较，si-CPNE1组膀胱癌细胞T24中CPNE1、CyclinD1表达水平及细胞A值、S期细胞所占比例明显降低，Cleaved-caspase-3表达水平、G2/M期细胞所占比例、细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，见表5，图9、10、11。

表5 低表达CPNE1对膀胱癌细胞T24增殖、细胞周期和凋亡的影响

图9 两组细胞凋亡流式图

图10 两组细胞周期流式图

图11 Western印迹检测两组CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

2.7高表达CPNE1可以逆转circ-RAD23B 低表达对T24增殖、细胞周期的影响 与pcDNA-NC组比较，pcDNA-CPNE1组膀胱癌细胞T24中CPNE1、CyclinD1表达水平、细胞A值、S期细胞所占比例明显升高，Cleaved-caspase-3表达水平、G2/M期细胞所占比例、细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；与si-circ-RAD23B+pcDNA-NC组相比，si-circ-RAD23B+pcDNA-CPNE1组膀胱癌细胞T24中CPNE1、CyclinD1表达水平、细胞A值、S期细胞所占比例明显升高，Cleaved-caspase-3表达水平、G2/M期细胞所占比例、细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，见表6，图12、13、14。

表6 高表达CPNE1可以逆转circ-RAD23B 低表达对T24增殖、细胞周期、凋亡的影响

图12 4组细胞凋亡流式图

图13 4组细胞周期流式图

1～4：pcDNA-NC组，pcDNA-CPNE1组，si-circ-RAD23B+pcDNA-NC组，si-circ-RAD23B+pcDNA-CPNE1组图14 Western印迹检测4组CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

3 讨 论

研究报道，circRNA参与了膀胱癌的进展过程，可作为潜在预后生物标志物和治疗靶标；如circACVR2A通过miR-626/EYA4轴抑制膀胱癌细胞增殖和转移〔11〕。circ_0058063下调削弱了膀胱癌细胞的增殖和迁移能力，使细胞停滞在G0/G1期〔12〕。研究结果提示，circ-RAD23B可能在膀胱癌中起促癌作用。本研究结果表明，抑制circ-RAD23B表达可抑制膀胱癌细胞T24增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡。

本实验发现circ-RAD23B靶向调控miR-708-5p的表达。研究报道miR-708-5p可诱导骨肉瘤细胞凋亡，且通过靶向锌指E盒同源结合蛋白(ZEB)1来抑制迁移〔13〕。抑制微小染色体维持蛋白3相关蛋白(MCM3AP)-AS1可通过上调miR-708-5p抑制胃癌MGc-803和SGC-7901细胞增殖并增强其凋亡〔14〕。抑制MINCR可通过上调miR-708-5p抑制结肠癌细胞增殖和迁移〔15〕。本研究结果表明miR-708-5p高表达可抑制膀胱癌细胞T24增殖，促进细胞凋亡。提示miR-708-5p在膀胱癌中可能起抑癌基因作用。

本研究通过在线软件预测miR-708-5p的可能靶mRNA，发现miR-708-5p可结合CPNE1。研究报道CPNE1高表达促进人肺腺癌细胞生长和转移〔16〕。CPNE1基因被沉默能够显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力〔17〕。miR-195-5p过表达可通过直接靶向CPNE1抑制非小细胞肺癌衍生细胞的增殖、迁移和侵袭〔18〕。本研究结果表明，膀胱癌细胞系T24、RT4、UM-UC-3中CPNE1 mRNA和蛋白表达水平升高；抑制CPNE1 表达可抑制膀胱癌细胞T24增殖，促进细胞凋亡。且miR-708-5p靶向调控CPNE1。此外，高表达CPNE1逆转了circ-RAD23B 低表达对T24细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。

综上，circ-RAD23B低表达可能通过miR-708-5p/CPNE1轴抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。