曲霉属的现代分类命名研究进展

刘警鞠 张雨森 陈娟 孙炳达 赵国柱

（1.北京林业大学生物科学与技术学院 林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；3.中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心，北京 100101）

曲霉属真菌分布广泛，是常见的食品、粮食、环境污染菌，部分种是重要的人体及动物条件致病菌，曲霉也能产生各种酶、有机酸、抗生素、代谢产物，在食品、酿造、医药等发酵工业、生物技术中有重要应用［1-8］。黄曲霉（Aspergillus flavus）污染粮食、食品、饲料引起霉变，产生致癌的黄曲霉毒素；烟曲霉（A.fumigatus）对器官移植、艾滋病等免疫缺陷患者引起的感染已超过念珠菌Candida spp.，成为临床上常见的真菌病原菌之一；而黑曲霉（A.niger）、米曲霉（A.oryzae）是酿酒、制酱、酱油生产等的主要发酵菌种，柠檬酸的生产主要依赖于黑曲霉；土曲霉（A.terreus）发酵产生的次生代谢产物洛伐他汀（lovastatin）等是临床上降胆固醇预防心脏病的重要药物；此外，黑曲霉（A.niger）和构巢曲霉（A.nidulans=Emericella nidulans）是基因工程、组学、遗传学、生物化学、细胞生物学、发酵工程等研究的重要模式生物。

近年来人们对曲霉的开发利用，毒素检测，曲霉病的防范越来越重视。《国际藻类、菌物、植物命名法规》（简称《墨尔本法规》）［9-10］“一个真菌一个名称（one fungus, one name, 1F1N）” 的规则于 2013年生效，使整个曲霉属的分类命名系统发生重大变化。了解曲霉的现代分类系统，正确鉴定、系统分类及规范使用名称，对于曲霉属真菌的国际国内研究、学术交流，相关行业的开发和应用都非常重要。

1 曲霉属的近代分类研究历史

曲霉属Aspergillus P.Micheli ex Haller最初由Micheli建立，拉丁名称“Aspergillus”，（源于一种天主教会用来洒圣水的装置“aspergillum”），用来描述该类真菌产生爆炸头式（喷洒式）的产孢结构（分生孢子头）特征。1768年由Haller合格发表，Fries于1832年认可了属名，灰绿曲霉Aspergillus glaucus（L.）Link（= Mucor glaucus L.） 为 该 属 模式种。曲霉属自建立起长期归属在无性型的半知菌门（类）。1854年，de Bary首次建立了无性型曲霉属Aspergillus与其有性型散囊菌属Eurotium的联系。Benjamin于1955年将曲霉属的有性型分为Eurotium、Emericella和Sartorya，随后对如何处理、描述、命名，分类曲霉及相关有性型一直存在争议。至《墨尔本法规》生效（2013）之前，曲霉菌的分类研究历史主要有两个时期及分类体系［11］。

（1）1985年以前，以Thom-Raper-Fennell为代表的传统经典分类系统［12-13］。该系统曾广泛应用，主要以形态分类为依据。认为人们接触的曲霉绝大部分为无性型，只有少数产生有性子囊孢子繁殖阶段，为避免不必要的命名混淆，将最早用来描述无性型的名称Aspergillus包含了无性型和有性型在内的全部种类，而不承认独立有性型名称的地位。在属与种之间的分类等级使用“群”（group），Raper在专著中，将所承认的150个种及变种划分为18个群［13］。但这不符合当时的《国际植物命名法规》（斯德哥尔摩法规），即真菌的第一个合格发表的有性型名称享有优先权。另外，由于“群”不是《国际植物命名法规》中规定的分类术语，不具有正式的分类学地位。因此，该分类体系虽然广泛应用，但一直存在很大争议，并被不断修改和完善［14］。

（2）1985年至《墨尔本法规》生效的2013年之前，曲霉有性型和无性型命名并存，但通常有性型被认为代表全型（holomorph），属下分亚属subgenus和组section，分子系统学研究结果在曲霉分类中逐步得到应用。1985年在荷兰阿姆斯特丹召开的首届国际青霉和曲霉研讨会上认为应把曲霉属以下分类等级正规化与《国际植物命名法规》一致，为了合法化曲霉属下的分类单位。同年，Gams等［15］根据形态学及对应有性型特征，引入了“亚属subgenus”和“组section”的概念和名称，将曲霉属分为6个亚属包含17个组（1个亚属未分组），对应1965年Raper & Fennell提出的18个群。而有性型另外分别归入了不同的有性型属，如Eurotium，Petromyces，Emericella等。

随着分子系统学技术的飞速发展，从《真菌学词典》第八版开始［16］，取消半知菌（亚门）类的高等级分类阶元，无性型真菌改称丝分孢子真菌（mitosporic fungi），以无性型为主的曲霉属Aspergillus也相应按照分子系统发育或对应的有性型归于子囊菌门（Ascomycota）下，但无性型和有性型名称仍然可以单独使用和命名。2000年，Pitt等［17］对曲霉类群进行了修正，接受了184个无性曲霉名称和70个相应的有性型名称。2008年，Peterson［18］建立曲霉属的多基因系统发育树，发现曲霉属的有性型属与无性型的6个亚属系统发育关系非常密切，Houbraken和 Samson［19］也支持这一观点。因此，在这一时期无性与有性虽然仍有争议，但大多仍然可以分别分类命名，各自独立合法使用，广义的曲霉大类群包含了无性型曲霉属Aspergillus及其相关的有性型属超过10个（表1）。

表1 曲霉原主要的有性型及相关属的处理Table 1 Treatment of major teleomorph and related genera of Aspergillus

2 《墨尔本法规》对曲霉现代分类命名的影响

2011年7 月，在第18届（墨尔本）国际植物学大会命名法分会上通过新的《国际藻类、菌物、植物命名法规》（简称《墨尔本法规》），与旧法规相比一个重大的变化是修改了第59条规则（article 59），对真菌命名采用“一种真菌，一个名称”即1F1N（one fungus，one name）的规则，规定从2013年 1月 1日起 1F1N 生效［9-10，20］。这一伟大的变革，具有划时代的意义，对真菌尤其复型多名称及无性型真菌影响巨大。法规改变原有性型名称优先代表全型的规定，真菌的无性型名称享有与有性型名称同等的优先权，如果无性型名称有效发表的时间更早，且被广泛使用和引用，则该无性型名称可以被用于表示全型真菌［10］，即一种真菌无论有性无性只保留一个优先合法的名称。这需要对2013年之前发表的所有曲霉属Aspergillus及其相关的有性型属种（上千个）名称进行全面的唯一性确认和修订。为此，国际青霉及曲霉专业委员会（InternationalCommission of Penicillium and Aspergillus, ICPA）针对曲霉属及其有性型属的处理以及命名问题展开了广泛讨论，审议了多种方案，其中主要三种方案影响比较大。

方案一，将曲霉无论有性还是无性型根据不同的系统发育分支拆分成相应的不同属，使用每一分支中最古老名称作为属名，如有性型的属名Neosartorya，Emericella，Petromyces等会保留代表不同分支的属名称。这个方案优点保留了主要有性型属名，而缺点在于，会导致一些常见和重要（无性型为主）的种，如黑曲霉A.niger、赭曲霉A.ochraceus、烟曲霉A.fumigatus和黄曲霉A.flavus等因在相应的系统发育分支中并非最早而需要更名，改到相应有性型属名下。

方案二，在方案一的基础上做了改善，保留曲霉属Aspergillus及重要种类，需要重新选择保留的Aspergillus的模式种（例如A.fumigatus或A.niger）。如果模式种选择A.niger，则属名Aspergillus可用于黑曲霉A.niger、黄曲霉A.flavus、米曲霉A.oryzae等，常见重要种类名称保持不变；其余种类归为保留的几个不同有性型名称的属，如原有性型的属Emericella、Neosartorya和Eurotium名称将分别用于容纳原曲霉属Aspergillus下的不同组sections，如Versicolores、Fumigati和Aspergillus中对应的种。这个方案基于经济及物种重要性考虑，缺点在于多个属需重新选择其他的模式种，有悖于命名法规，导致命名混乱，会引起争议。

方案三，继续保留最早的曲霉属Aspergillus的名称及模式种灰绿曲霉A.glaucus，将相关的有性型名称视为Aspergillus联系在一起的具有生物学意义的结构特征（异名）。如，A.glaucus（原无性型）被保留，则其原有性型名称蜡叶散囊菌Eurotium herbariorum则被废弃，但可以描述该种有性型为产生散囊菌型（Eurotium-type）的子囊座（ascomata）；这样曲霉属Aspergillus原有性型属，如Neosartorya、Emericella、Eurotium和Petromyces等及一些相关属Dichotomomyces、Polypaecilum 和 Phialosimplex将 成为曲霉属Aspergillus的异名属。这个方案使得大多数曲霉保留无性型名称的同时其有性型名称（异名）能以所代表的特征而出现在Aspergillus名下，有利于命名法的稳定性，便于不同领域人员的使用和理解，得到了ICPA和大多数分类学者的认可，被逐步广泛采用（http://www.aspergilluspenicillium.org/images / PDF / minutes.pdf）。

对曲霉属的界定还存在其他的观点，Pitt和Taylor［21-22］对曲霉及其相近属之间的系统发育关系研究，认为青霉属Penicillium是曲霉属巢状亚属（subgenus Nidulantes）的姐妹分支，主张将曲霉属分成几个小属，不同亚属沿用相关有性型属名，如将subgenus Nidulantes改为裸胞壳属Emericella，将subgenus Aspergillus改为散囊菌属Eurotium。但Samson等［1］认为这种划分方式会破坏曲霉属的单系性，引起不必要的名称改变，坚持将曲霉属作为一个单系属，并在属下划分不同的亚属。

3 曲霉属的分类研究现状

围绕《墨尔本法规》的1F1N规则及ICPA的方案，随后曲霉属及相关的无性有性属种的大规模的系统分类修订展开，新修订更注重分子系统发育学及多相分类方法的应用。其中最系统代表性工作为荷兰菌种保藏中心（CBS）的Samson团队基于收集到的Aspergillus模式菌株（ex-type）系统研究结果［1］。其推荐曲霉的标准现代多相分类方法主要包括：一、分子鉴定及系统发育，测定通用DNA分子条形码（barcoding）ITS及特定的第二条形码基因（钙调蛋白CaM，β-微管蛋白BenA及RNA聚合酶II第二大亚基 RPB2）（表2）［1］；二、形态学特征（基物、标准培养基、菌落、培养条件、分生孢子头、子囊孢子等）；三、代谢物谱（extrolite）分析（毒素、酶、有机酸、抗生素及其他次级代谢产物）。通过系统发育分析显示曲霉菌Aspergillus与传统的9个相关有性型属为单系分支与青霉菌密切相关；根据《墨尔本法规》1F1N条款及ICPA的意见，接受保留Aspergillus作为曲霉属唯一合法的名称，相关有性型属处理为Aspergillus的异名；重新修订了属级分类特征；对已接受尚缺乏曲霉Aspergillus名称的种引入了5个新名称，21个新组合；更新了接受的曲霉属种，包含339种；对于仅有标本，没有模式菌株或DNA序列条形码及其他资料信息不全的16种列为排除和怀疑的种。此研究奠定了《墨尔本法规》之后，Aspergillus系统分类修订研究基础。

表2 曲霉属真菌PCR基因片段，引物及相关参数Table 2 Gene fragments，primers and related PCR parameters of Aspergillus fungi

在Samson分类框架下，国内外学者近年来对Aspergillus及其属下分类单位进行了更为系统的研究，一些基于基因组、代谢物谱、蛋白质谱分析的新技术、新方法也被推荐应用曲霉系统分类、代谢产物筛选预测、致病性分析中，如全基因组测序分析（whole genome sequencing，WGS）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF MS）、（超）高效液相色谱结合二极管阵列检测质谱分析（（ultra）high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection and mass spectrometry, UHPLC/HPLC-DAD-MS）等［23-34］。其中Houbraken等［34］根据系统发育分析结合表型、生理型、代谢物结果进行最为系统的总结更新，并在原组section的等级下引入系/族series的等级，认为将曲霉种分配到相应的系series，可以高度预测物种可能具有的功能特征，在使用基于表型的识别时可能是有用的，同时补充Aspergillus从339种［1］到446种［34］，形成了包括亚属、组、系、种的曲霉属真菌最新现代分类系统。即Aspergillus为唯一合法属名，为真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），散囊菌纲（Eurotiomycetes），散囊菌亚纲（Eurotiomycetidae），散囊菌目（Eurotiales），曲霉科（Aspergillaceae），曲霉属（Aspergillus）真菌总称。灰绿曲霉A.glaucus（L.）Link为曲霉属模式种，属下包含6个亚属（subgenera），曲霉亚属（subgenus Aspergillus）、环绕亚属（subgenus Circumdati）、淡黄亚属（subgenus Cremei）、烟色亚属（subgenus Fumigati）、巢状亚属（subgenus Nidulantes）和多拟青霉亚属（subgenus Polypaecilum），27个组 sections，75个系 series（附表），全部的有性型及相关属被处理为Aspergillus的异名或从中移除独立（表1）［34］。另外，ICPA网站（https://aspergilluspenicillium.org/）上也列出接受的曲霉种，并为每种提供了正确名称、对应的异名（包括原有性型）、模式（标本）type、模式菌株ex-type（保藏机构菌株编号）、属于哪一组section、DNA第一条形码ITS及大部分第二条形码（BenA，CaM，RPB2）序列注册号等，非常方便使用者查证和参考。

4 全基因组序列分析（whole genome sequencing，WGS）在曲霉属研究中的应用

近十年，以Illumina，PacBio为代表的高通量测序技术成熟，其通量高、准确率高、周期短、费用低的特点为真菌全基因组分析提供了强有力的支撑。曲霉一些重要亚属、组、种类、不同菌株全基因组已获得（表3），为深入研究曲霉基因组结构特点、遗传多样性、系统发育关系、比较致病性、预测或筛选关键酶和代谢产物、鉴定特定基因等及曲霉资源开发提供了丰富的信息［30］。

表3 曲霉重要种类的基因组分析情况Table 3 Genomic analysis of important Aspergillus species

2018年，美国科学家对A.arachidicola进行全基因组测序，并通过基因组学比较，推断出其与A.parasiticus为一个祖先的可能性最大［35］。同年丹麦技术大学、美国联合基因组研究所（JGI）等机构在Nature Genetics发文，公布了曲霉属黑色组Nigri大规模基因组测序分析结果，获得该组完整26个种的基因组概况（包括23个种首次基因组从头测序）；建立该组种间及种内遗传图谱，并利用基因组信息预测了17 903个碳水化合物活性酶（CAZymes）和2 717个次级代谢物基因簇，发现了数千种新基因［31］。

对致病性的烟曲霉A.fumigatus 12个菌株的泛基因组（Pan-genome）分析，预测了116 230个推测蛋白及其相应的基因组位置。发现80%-90%的基因模块是在所有菌株中高度保守的核心基因。剩余的“附属”基因模块聚集在基因组的亚末端区域，可能与发病机制和抗生素耐药性有关［36］。Steenwyk等［37］和 Bartoletti等［38］从一名被曲霉属真菌导致继发性感染的COVID-19患者体内分离得到4株烟曲霉菌株CAPA A-D，表型特征和系统发育分析鉴定结果表明这些菌株与烟曲霉参考菌株A.fumigatus Af293和A1163并没有明显的差异存在；而通过基因组分析发现，与A.fumigatus Af293和A1163相比，CAPA A-D在毒力及相关性状上表现出的菌株特异性是由编码毒性蛋白的基因缺失突变引起。唑类药物是预防和治疗曲霉病的有效药物，但长时间使用可能导致曲霉菌基因组的代偿性突变，导致曲霉菌耐药菌株的出现［39-41］。通过对耐药菌株的全基因组分析，分生孢子中CYP51A基因的突变是导致耐药性出现的主要原因，根据这一发现，针对CYP51A基因突变的新型药物已经研发成功［42］。

曲霉属黄绿组（sect.Flavi）是一重要类群，既包括有益的菌株，又有有害的种类，如用于食品发酵和酶生产的米曲霉A.oryzae，以及引起食物变质和产生真菌毒素的黄曲霉A.flavus。基因组测序技术如何精准的区分识别这些菌种及他们基因组水平上的差异。大规模基因组测序分析系统发育关系表明，A.oryzae的近缘种不是A.flavus而是A.minisclerotigenes或A.aflatoxiformans，并且鉴定出了基因组的高度多样性，尤其是亚端粒区。预测黄绿组曲霉有大量的碳水化合物活性酶和次级代谢基因簇（每个菌株 73 个）［43］。

截止2021年6月，GenBank中已报道曲霉属115种485个/株全基因组序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Aspergillus），基因组大小从23.887 Mb（Aspergillus cejpii FS110）到77.556 Mb（A.latus ASFU1710）；已注释的编码蛋白质数量为7 761（A.rambellii SRRC1468）-19 260（A.fumigatus Af293）；GC含量：43%（A.coremiiformis CBS 553.77）-53.1%（A.olivimuriae NRRL66783）；tRNA 数 量：138（A.sydowii CBS593.65）-333（A.violaceofuscus CBS 115.71）；已注释的基因数9 301（A.coremiiformis CBS 553.77）-15 384（A.calidoustus CBS 121 601）。与经典的扩增子条形码相比，全基因组测序为曲霉的系统发育，基因分析、代谢调控、物种资源挖掘等研究提供更全面丰富的信息，将成为未来曲霉研究的重要方向和手段。

5 我国曲霉属分类研究及展望

我国曲霉应用历史悠久，物种多样性丰富。齐祖同［14］主编《中国真菌志·第五卷·曲霉属及其相关有性型》（以下简称曲霉志），以Raper等［13］和Gams等［15］的分类系统为基础，研究包含我国曲霉属14个组的82个种及变种；其中有26个具有性型，分别隶属于子囊菌的裸胞壳、散囊菌、新萨托菌和石座菌4个属。此后见一些零星的种类报道［44-48］。Chen 等［26-27，49］通过在荷兰菌种保藏中心（CBS）访学交流，对世界范围内（包括我国部分）曲霉属巢状组、曲霉组等进行了系统的多相分类研究。我国对曲霉总体生产应用及污染防范较为关注，遗传学及基因生物工程研究较多，但是《墨尔本法规》之后，面对整个曲霉分类系统的巨大变化，缺乏系统全面的分类修订研究，影响其他相关领域的发展。如我国著名的茯砖茶核心发酵菌株‘金花菌’，曾认为是灰绿曲霉群Aspergillus glaucus group、匍匐曲霉A.repens、谢瓦氏曲霉A.chevalieri、冠突曲霉A.cristatus、冠突散囊菌Eurotium cristatum等，近年在食品发酵行业更多的认同冠突散囊菌［50-51］，但后两者实际为同一菌种的无性-有性型，按《墨尔本法规》及现代曲霉分类系统，应该保留和使用的为冠突曲霉A.cristatus名称。

通过对我国主要的菌种保藏机构收集的曲霉菌种的调查发现，来自土壤、粮食霉污、酿造等相关环境较多，一些来源历史久远，缺乏分子鉴定数据，还有部分以有性型名称收录（表4）。我们对收录于《曲霉志》中的以及其他保存于CGMCC（中国普通微生物菌种保藏管理中心）的原属裸胞壳属菌株进行了重新鉴定和定名［52］。对保存于CGMCC的其他300余株曲霉系统整理，分析发现其中大部分来自于土壤，时间跨度大，从1952-2015年不等，多为上世纪50-60年代收集，保藏时间久远，主要以形态分类鉴定为主，沿用的分类系统古老，缺乏分子数据，分类鉴定命名问题较多。我们按照《墨尔本法规》1F1N规则，经过形态及分子生物学研究，对其进行重新鉴定复核，共鉴定出曲霉属51种，分布于4个亚属，11个组，包括中国新记录种20个；鉴定名称发生变化的菌株有279株，占总比例（317株）的88%；例如菌株CGMCC 3.03554原鉴定为A.niger（黑曲霉），通过我们的多相分类鉴定为A.flavus（黄曲霉），另有18个菌株排除出曲霉属［53-54］。

表4 我国主要菌种保藏机构收集曲霉及主要有性型属情况Table 4 Information of Aspergillus and major related teleomorph by major strain collection institutions in China

曲霉属真菌既包括能够引起食品霉变、人类和动物疾病的有害菌，又包括代谢物丰富，能应用于生产生活的有益菌。曲霉菌种类的准确鉴定有利于有益菌的充分开发利用，更有利于有害菌的防治。但是我国传统的曲霉属鉴定和分类以形态和菌落培养特征为主，缺乏分子数据，有性无性名称缺乏关联，名称使用不规范，有性型名称仍然应用，不适应《墨尔本法规》新的分类命名体系，给霉菌的防治和疾病病原的精确诊断及对症治疗等带来很大影响。我们建议十分有必要积极参与国际前沿研究合作，以《墨尔本法规》为指导，参照国际模式标本菌株材料，采用国际标准多相分类方法，同时引入全基因组测序分析手段，重新鉴定、分类、修订、评估我国曲霉的分类与多样性及系统发育关系。为挖掘重要种类的基因组学数据信息，寻找新的及重要的曲霉物种及基因资源，探索曲霉菌引起的疾病的治疗切入点，开发霉菌代谢产物，研制新型防霉剂提供重要参考，为工农业生产、粮食食品环境安全、人们健康提供保障和支撑。

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