五胜肽的合成研究

郑 博

（渭南师范学院 化学与材料学院，陕西 渭南 714099）

五胜肽属于短肽，被应用于化妆品方面，它可促进肌肤胶原蛋白的生长，并提高肌肤锁水能力，长期使用可增强细胞修复力，使肌肤年轻化，改善静态纹[1]。现如今，人们已经从一些短肽的合成延伸到人们理想的任意肽段。多肽还被广泛应用于医疗、卫生、保健、食品等方面，从而扩大了多肽研究领域，使其对化学、生物学、医药学、免疫学等的研究具有巨大的推动作用和应用价值。

五胜肽是具有生物活性的多肽，通过Fmoc去保护，利用赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸以及Pal为合成原料，采用合适的固体缩合剂TBTU和液体缩合剂DIEA，经过反复的去保护-偶联后，通过切割载体树脂，最终合成了含有5个氨基酸偶联成的一条Pal-Lys（Boc）-Thr（tbu）-Thr（tbu）-Lys（Boc）（Pal-L-TT-L）多肽。多肽是由多个氨基酸有次序地进行氨基和羧基的缩合，通过肽键共价连接成长短不一的链状化合物。近年来，由于Fmoc固相合成法具有反应条件温和，产率高，在酸处理中不受影响，操作简单，且Fmoc自身具有紫外吸收，易于监测，便于实现自动化等优点[2,3]而被广泛应用。Fmoc固相合成法的缩合剂大多采用TBTU/HOBt/DIEA[4-6]，这种缩合剂体系明显缩短了接肽反应时间，减少副反应，也有利于抑制消旋反应的发生。

Fmoc固相合成采用的载体由两部分组成：高分子树脂和连接分子。正确的选择树脂与连接分子决定了固相合成的效率。本实验采用Wang树脂作为载体。由于多肽固相合成的飞速发展，新型树脂和缩合剂不断被发现，合成技术不断成熟，自动化程度不断发展，使得多肽的合成效率明显提高。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

AUW120D型电子天平（岛津仪器公司）；SHBIIIA型循环水式真空泵（林茂科技公司）；DHG-9023AS型鼓风干燥箱（中新医疗仪器有限公司）；JX-10型干式恒温器（上海净信实业发展有限公司）；LCMS 1260-6430型液质联用仪（安捷伦公司）；TD-5R型台式低速大容量离心机（济南欧莱博技术有限公司）；VORTEX-1型旋涡混合器（济南程腾生物技术有限公司）；PS-40A型超声波清洗器（深圳市得康洗净电器有限公司）。

所有试剂均为分析纯。丝氨酸树脂（Fmoc-Ser（tbu）-Wang.Resin）（S）（Wang树脂）、赖氨酸（Fmoc-Lys（Boc）-OH）（K）、苏氨酸（Fmoc-Thr（tbu）-OH）（T）（Fmoc）、棕榈酸（Pal）、2,2-二甲基甲酰胺（2,2-dimethylformamide）（DMF）、甲醇、乙醚、无水乙醇、二氟甲烷（difluoromethane）（DCM）、乙腈、乙酸乙酯、茚三酮、吡啶、六氢吡啶（piperidine）（DBLK），北京化学厂；N-二异丙基乙胺（N-diisopropylethylamine）（DIEA）、1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（1-oxygen-3-dimethylamine carbonyl benzotriazolium boron tetrafluoride salt）（TBTU）、六氟磷酸苯骈三唑-1-基-氟基三吡咯烷基（Hexafluo rophosphate benzotriazol-1-yl-fluoro-tripyrrole alkyl）（PyBOP）、1-羟基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole）（HOBT）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid）（TFA），Alfa Aesar；苯酚（青岛恒瑞厂）；实验中使用的超纯水（大于18MΩ·cm-1）；工业氮（青岛鲁东气体有限公司）。

1.2 五胜肽的合成原理

（1）将Wang树脂载体通过脱帽液去除Fmoc保护；（2）将要合成肽链的第一个氨基酸的羟末端的羟基以共价键的结构同该高分子树脂相连，即第一个氨基酸偶联完成，见图1。

图1 第一个氨基酸的偶联合成路线Fig.1 Coupling synthetic route of the first amino acid

第一个氨基酸合成后，将此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分，再经过脱去氨基保护基，并同第二个氨基酸的羟基组分反应。重复“缩合→洗涤→去保护→中和洗涤→下一步缩合”操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，即得到所要合成的多肽粗品。

1.3 五胜肽的合成过程

1.3.1 准备工作

（1）肽序列的核对 从右往左，最右边第一个是树脂。

（2）树脂的选择 肽序列长度越长，选择的树脂替代度越低，反之则长度越短，选择的树脂替代度越高。一般2～50肽为短肽，50肽以上为长肽。该肽是五肽，属于短肽，用的是Fmoc-Ser（tbu）-Wang.Resin树脂（纯度为0.35mol·g-1）。

（3）树脂的称取 产品中多肽含量设为0.1mmol，由树脂纯度计算可知，需称量Wang树脂的质量约为0.29mg。

1.3.2 溶胀树脂 把称好的树脂倒进反应柱里，加入DCM溶胀30min，使树脂溶胀完全。

1.3.3 洗涤 树脂溶胀完全后，抽掉反应柱里的溶剂，向其加入DMF溶剂，不停旋转活塞，并在其中充入不同压强的N2洗涤，旋转时间大约10s左右，抽掉溶剂。重复操作，再用DMF洗两遍，共用DMF洗涤3遍。

1.3.4 去保护 抽干反应柱里的溶剂，向其加入脱帽液，鼓气，脱帽5min后，用DMF洗一遍抽干，再加入脱帽液，脱帽10min。第二次脱帽结束后，用DMF洗涤6次（不能少于6次）。

1.3.5 偶联 按多肽序列，依次称取各氨基酸的质量，由于反应过程中会受温度、压强、副反应、反应时间等各种因素的影响，造成反应不完全，引起多肽不能完全偶联。所以称取氨基酸的质量一般在标准量的3倍，目的是为了保证多肽能够完全偶联（见表1）。

表1 各氨基酸的称取质量Tab.1 Weight of each amino acid

氨基酸完成称量后，把反应柱里的溶液抽干,将药品投入反应柱，加入DMF溶剂，再加入液体激活剂DIEA 0.1mL，鼓入N2反应30min。

1.3.6 检测 反应后，用滴管移取少量反应液置于小试管中，再向其中分别加入3D 50%苯酚、3D吡啶、3D茚三酮，摇匀，放入检测器中检测150s。取出小试管放在透明的白纸上进行对照，若溶液出现亮黄色，沿着试管壁倒掉溶液，试管壁上会附有树脂；再次在透明的白纸上对照，树脂呈透明状，则说明该氨基酸已经完成偶联。抽掉溶液，重复步骤3～6，依次偶联两个苏氨酸和赖氨酸以及Pal，由于Pal呈牛奶状，会附在试管壁上，所以偶联Pal时，要进行加热搅拌。

1.3.7 收缩 因Pal没有保护基，不用去保护再收缩，直接进行收缩。但若最后一个偶联的是其它氨基酸或带有保护基的物质，则要先去保护再收缩。收缩的过程是先用DMF洗3次，再用DCM洗3次，最后用甲醇洗3次。取出试管将水分完全抽干。

1.3.8 切割与沉淀 各氨基酸完成偶联后，需将树脂切割掉，才能得到五胜肽。首先，需在50mL圆底烧瓶中加入5mL暗黄色切割液（86%TFA+4%苯甲硫醚+5%EDT+3%蒸馏水+2%苯酚），封好圆底烧瓶口，置于30℃的干式恒温器中振荡2h。随后，将烧瓶中的液体倒入50mL离心管中，缓慢加入乙醚，此时有发烟现象，将离心管口封住放入台式低速大容量离心机（2800r·min-1）中离心2min，倒掉上层浑浊液，得到下层白色固体。再向其中加满乙醚封口，放于旋涡混合器中，将50mL离心管中的白色固体振散，放入台式低速大容量离心机（2800r·min-1）中离心2min。此操作重复两次。用2mm毛细玻璃管蘸取少量液体，移入5mL离心管，用胶头滴管滴入1D乙腈和1D蒸馏水，放入超声波清洗器中振荡5s，使其充分溶解。将其置于小型台式离心机中离心2min（1200r·min-1）。用液质联用仪进行检测，将所合成的肽粗品半封口，放入干燥器中干燥。

1.3.9 鉴定多肽 经过上述操作，合成的多肽粗品通过质谱分析是否含有所需目标产物。取少量该多肽粗品，经过ESI-MS方法鉴定。设置的条件为：样品溶解于甲醇，通过注射泵打入电喷雾质谱。电喷雾质谱条件：喷雾器压力7.0，流速4.0或8.0L·min-1，温度300℃。喷雾针电压为4.0kV，N2干燥。通过对比质谱图所得的分子量与最高峰的理论值，确定是否得到目标产物。

2 结果与讨论

2.1 树脂溶胀不完全影响反应的合成

树脂中加入DCM后，溶胀时间越长，树脂溶胀越完全。溶液随加入DCM时间的变化，见表2。

表2 树脂的溶胀时间与变化现象Tab.2 Resin swelling time and change phenomenon

由表2可以看出，刚加入DCM时，树脂沉在底部，与DCM溶液完全分层，通过延长反应时间，树脂慢慢被DCM溶胀开，溶液开始变得浑浊，30min后树脂完全溶胀。

2.2 影响氨基酸偶联的因素

标准的检测现象应为溶液亮黄，树脂透明。若检测时出现溶液暗黄、红色、绿色，或树脂出现蓝杂、绿杂、黄等情况，说明氨基酸没有偶联上，需要重新偶联。出现这些情况的原因可能是：

（1）反应时间较短，氨基酸没有完全偶联，可通过延长一定的反应时间，然后再检测。检测结果随氨基酸偶联时间的变化见表3。

表3 某个氨基酸偶联时间的变化所产生的检测结果Tab.3 Test result produced by the change of the coupling time of a certain amino acid

由表3可以得出，投料到反应进行10min和20min时，检测结果都不符合标准，说明该氨基酸没有完全偶联。当反应进行30min时，检测结果符合标准，说明该氨基酸已经完成偶联，可以进行下一个氨基酸的偶联。

（2）称取氨基酸的量不够，导致多肽不能完全偶联。由于反应过程可能伴随副反应发生，受反应时间、缩合剂等因素的影响，会导致氨基酸没有完全偶联。即使偶联上了，最终得到多肽的量并没有达到目标产物的量，即合成多肽的量不够，因此，我们一般按氨基酸理论值的3倍进行投料。

（3）固体激活剂和液体激活剂选择不正确。在发生反应偶联时，如果固体激活剂和液体激活剂没有进行合理搭配或投料时所加的激活剂种类不同，都会导致氨基酸不能完成偶联。激活剂的搭配和反应时间的控制见表4。

表4 激活剂的搭配与反应时间Tab.4 Activator mix and reaction time

在称取氨基酸时，若所用的固体激活剂为TBTU和PyBOP，则需添加的液体激活剂为DIEA；若所采用的固体激活剂为HOBT，则所用的液体激活剂为DIC，且使用该激活剂时必须加热。由于反应时间过长会破坏多肽结构，所以固定的固体激活剂和液体激活剂混合时需严格控制反应时间。

（4）溶液里出现大量泡沫或沉底。这与N2阀门所开的大小有关，阀门开的太大或太小都会影响反应结果，所以应调节阀门，使N2通入量适中。

（5）未按照检测标准进行检测。添加检测液的量适中，不能多加或少加。且必须正确把握检测时间，一般检测时间为150min，若超过150min，溶液会变黄或黑。则在氨基酸没有偶联上时，不能进行脱帽连接下一步反应，应用DMF清洗3遍，重新称取没有偶联上的氨基酸的质量，进行再次偶联，直到该氨基酸偶联上，再进行下一步反应。

若检测结果显示氨基酸并没有偶联上，就进行了脱帽，那么，所合成的多肽就不是目标肽。

2.3 质谱鉴定分析

采用质谱法对合成的多肽进行鉴定，得到该多肽的实际分子量，见图2。

图2 五胜肽质谱检测分析结果Fig.2 Analysis of matrixyl mass spectrometry

图2为合成的五胜肽粗品的质谱检测分析结果。样品中含有一个主成分、两个次要成分及多个微量成分。

由图2可知，样品中主成分的分子量为802.26，而五胜肽理论分子量为802.1，相差了0.16（如果理论上的分子量和实际的分子量相差不超过1，则表示已合成多肽粗品）。该实验结果与理论值基本相符。通过质谱检测分析得出，已成功制备五胜肽粗品，要得到五胜肽精产品，还需进行纯化等处理。

3 结论

该实验在氨基酸的偶联过程中，使用了TBTU固体激活剂和DIEA液体激活剂，此类激活剂反应速率快，无副反应发生，操作简单，无需加热。且按标准称料，正确把握反应时间，严格按照多肽的合成过程进行，每一步反应的结果都符合溶液亮黄，树脂透明的检测标准，使氨基酸完全偶联。通过切割后，将树脂切掉，再经过离心沉淀，成功制得了五胜肽粗产品。最后经过液质联用仪质谱表征，为氨基酸保护及多肽的合成提供了实验依据和理论参考。最终测得五胜肽的分子量为802.26，与理论值相一致。

该五胜肽的合成方法简单方便，合成率高，可应用于更多短肽的合成。人们可以按照想要合成的多肽次序和长度，探究更多肽的种类，使多肽的研究领域更为广阔。