辣木籽化学成分及其调控内源细胞因子TNF-α活性研究

罗雪婷，钟 瑜，林锐涛，欧滨获

(中科检测技术服务(广州)股份有限公司，广东 广州 510000)

0 引言

辣木是一种原产于印度的乔木，其种子被称为辣木籽。辣木籽富含优质油脂，经提取所得的辣木籽油的油酸含量可达到70%[1]。近年来，大量研究显示，辣木籽除了含有大量的油脂外，还含有大量其他营养成分，如蛋白质、维生素等，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、降血脂、降血糖、护肝等多种功效。另外，其还含有能够使浑浊水在短时间内澄清的活性蛋白，为水质净化提供了新思路[2-4]。本文将针对辣木籽活性成分进行深入研究，并以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为靶标，采用体外细胞模型筛选，以诱生抗病毒细胞因子的天然小分子化合物，旨在为进一步开发辣木籽的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本材料

研究所用辣木籽均采自于云南昆明，样本保存在天然小分子重点实验室内，RAW264.7细胞购自于ATCC。

1.2 试验试剂及仪器

1.2.1 研究试剂

表1 实验试剂

1.2.2 实验仪器

见表2。

表2 实际仪器

1.3 实验过程

1.3.1 提取及分离

取干燥好的辣木籽3795 g，进行粉碎后过80目筛，采用甲醇进行回流提取3次，每次2 h。将滤液合并后，使用布氏漏斗进行抽滤，将滤液使用旋转蒸发仪解压回流，直至样本无甲醇味后烘干，得到辣木籽粗提物[5]。取300g粗提后的辣木籽，再次使用甲醇溶解后裹80目硅胶，减压旋干至粉末状。利用硅胶柱层析，将不同极性成分分开，再依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等5种不同且极性递增的溶剂来对样本进行洗脱，再进行减压回流浓缩处理，得到不同溶剂洗脱萃取物共计5种。这5种不同溶剂萃取物分别为石油醚萃取物Fr.A、氯仿萃取物Fr.B、乙酸乙酷萃取物Fr.C、丙酮萃取物Fr.D 和甲醇萃取物Fr.E。

1.3.2 分离纯化

取甲醇萃取物Fr.E，将其采用D101大孔吸附树脂(AB-8)柱进行层析，再利用纯水和甲醇对其再次进行洗脱处理后，将洗脱液收集好。将洗脱液按照2L一个分流的标准进行分流，共计得到20个分流，将其进行编号，分别为Fr.1-20。取其中的Fr.3作为研究样本，使用硅胶柱进行层析，再使用氯仿-甲醇-水(从100∶0∶0至2∶1∶0.1)对样本进行梯度脱洗，再次得到24个流分，即Fr21-44。按照6∶4的比例配置乙醇和水的混合液，向其中加入Fr.39，采用葡聚糖凝胶色谱Sephadex LH-20柱对其进行层析，采用配置好的乙醇水和无水乙醇洗脱，即得到化合物1。

将丙酮萃取物Fr.D同样使用硅胶柱进行层析，再用氯仿-甲醇-水(100∶0∶0-7∶3∶0.5)对其进行梯度洗脱，继而得到32分流，取其中的1个分流，利用硅胶色谱柱、Sephadex LH-20柱色谱进行层析、洗脱后，再采用反相键合相色谱和高效液相技术进行分类纯化[6]，即可得到化合物2-11。

1.4 调控内源TNF-α实验

1.4.1 细胞培养及处理

以DMEM作为基础培养基，加入适量的胎牛血清、2 mL/L-glutamine和抗生素，接入小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)与单核巨噬细胞进行培养。在96孔板各个孔内加入200 μL细胞培养液，对细胞进行种植。当细胞增殖并达到培养皿面积的70%-80%左右后，向各个孔内加入辣木籽各组分提取物，给药剂量按照梯度设计，分别为27.5 μg/mL、55 μg/mL、110 μg/mL与220 μg/mL，同时使用脂多糖(LPS，1 μg/mL)作为阳性对照组。

1.4.2 引物设计及实时荧光定量PCR

利用NCBI网络数据库数据，选取具有高特异性和较低Tm值的引物序列，TNF-α正向引物设计为5’-ATGGCTTCCCTCTCATCTGT-3’；反向引物为5’-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3’。

在提取RNA时，先将悬浮细胞重悬，贴壁细胞采用0.25%胰蛋白酶消化，然后置入4 ℃PBS缓冲液内。将细胞转移到新EP管内离心5 min，弃去PBS缓冲液，再次在管内加入500 μL的Trizol重悬细胞，静置于冰面上10 min后，采用Trizol法裂解细胞，并将细胞RNA提取纯化。将纯化的RNA组作为模板，采用cDNA合成逆转录试剂盒，以实时荧光定量PCR预混体系(探针法)进行定量分析，采用美国伯乐PCR系统，以GAPDH作为样本内参，正向引物采用5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物采用5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。

1.4.3 一氧化氮浓度及抗病毒细胞因子测定

采用Griess试剂对脂多糖以及样本细胞培养液内的亚硝酸盐浓度进行检测，抗病毒因子TNF-α含量测定采用酶联免疫吸附法，配合相关试剂盒按照说明书操作[7]；使用酶标仪对样本吸光度进行测定，测定条件设定为450 nm。

1.4.4 细胞因子蛋白分泌水平测定

按照27.5 μg/mL、55 μg/mL、110 μg/mL与220 μg/mL的浓度梯度，给予RAW264.7细胞辣木籽提取物药物刺激，以1 μg/mL脂多糖为对照组，在给药刺激24 h后，收集样本上清液，采用流式多因子检测试剂盒对上清液中的IL-2、IL-6、IL-12以及TNF-α等细胞因子蛋白分泌水平进行测定[8]。

1.4.5 相关蛋白检测

采用蛋白免疫印迹对相关蛋白进行检测[9]，在提取蛋白时，先将细胞浓度调整至105cell/mL，再置入6孔板内进行细胞培养，待细胞贴壁后将其培养基移除，再分别向孔内加入药物，培养24 h后，胰酶消化收集细胞。将收集到的细胞采用预冷过的PBS清洗后，加入细胞裂解液进行离心处理，取上清液备用。在对细胞蛋白浓度进行测定时，采用BCA法[10]，测定完毕后再次使用细胞裂解液将各个孔内的蛋白浓度调整到相同，再加入适量的SBS上样缓冲液进行变性处理。对于处理好的蛋白样本上样电泳，将其蛋白进行分类处理，将分离得到的蛋白转模到PVDF膜上，剪切出相应蛋白。经洗膜—封闭—洗膜—一抗孵育—洗膜—二抗孵育—洗膜处理后，采用化学发光免疫条带检测试剂盒，显色特异蛋白条带。

1.5 统计处理

2 结果与讨论

2.1 提取和分离

称取3795 g辣木籽，并对其进行提取，共计提取到辣木籽粗提物313.4 g，再次将粗提物进行提取和分离，以不同洗脱剂洗脱处理后，得到5种萃取物，其质量分布为石油醚萃取物Fr.A88.8 g、氯仿萃取物Fr.B7.5 g、乙酸乙酯萃取物Fr.C4.4 g、丙酮萃取物Fr.D9.8 g以及甲醇萃取物Fr.E175.8 g。

2.2 成分结构鉴定

对研究所得的化合物1-11进行分析，化合物分子式见表3。其中化合物2和化合物5为新发现的化合物单体。

表3 化合物1-11分子式

2.3 提取物活性筛选

将辣木籽提取物(1，2，5，6)利用RAW264.7细胞进行处理，对细胞毒性进行检测，发现当4个化合物浓度低于220 ug/mL时不具有细胞毒性。在测试亚硝酸盐浓度时，发现这4种化合物都能够刺激RAW264.7细胞产生亚硝酸盐。与空白组细胞相比，4组化合物(220 ug/mL)在给药后，样本NO浓度均明显上调(P<0.05)，但浓度要低于脂多糖(LPS)刺激组(P<0.05)。对比4组化合物刺激效果可见，化合物1给药刺激产生的亚硝酸盐浓度最高(见表4)，表明在这4种辣木籽提取物中，化合物1的激活效应最佳。

表4 提取物刺激细胞24 h效果分析

2.4 化合物1对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

鉴于辣木籽提取物中化合物1的激活效应最佳，故而以化合物1来进行后续实验。采用荧光定量PCR法，对化合物1刺激后的细胞抗病毒因子mRNA进行活性筛选，检测细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ与TNF-α等。通过检测发现，在被化合物1刺激后，细胞TNF-αmRNA含量明显升高，且呈现剂量依赖性(见表5)，表明RAW264.7细胞分泌TNF-α的过程可受到化合物1的调控，且这个调控效果与给药剂量呈现正相关。由此可见，化合物1能够从基因mRNA以及蛋白水平方面刺激细胞分泌TNF-α。

表5 化合物1对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

2.5 化合物1对TNF-α蛋白表达的影响

为了明确化合物1是通过何种机制来刺激RAW264.7细胞产生TNF-α蛋白，本次研究选取了不同信号通路对其作用机制进行检测，通过蛋白免疫印迹试验可见，化合物1在27.5 μg/mL-220 μg/mL浓度范围内，能够激活P38蛋白和磷酸化JNK蛋白，并利用MAPK信号级放大作用，将辣木籽的刺激信号传递到细胞核相应的靶基因对应位置上，刺激细胞增殖、分裂(见图1)。通过对NF-κB信号通路分析发现，只有给药浓度升高至220 μg/mL时，化合物1才能够激活细胞的P65蛋白磷酸化，同时出现IKBα蛋白解聚现象，IKBα通过泛素途径逐渐被降解，而被磷酸化的P65则携带着上游信号进入细胞核内部，然后锚定在细胞核蛋白某个特定的序列上，启动多种蛋白转录翻译。

图1 化合物1对TNF-α相关蛋白表达影响

3 结论及展望

本次研究以辣木籽作为研究对象，对其化学成分进行分析鉴定，研究共计从辣木籽提取物中鉴定出11个化合物。进一步研究发现，这11个化合物，化合物1、化合物2、化合物5和化合物6均能够刺激巨噬细胞产生NO，激活巨噬细胞的抗病毒作用。在这4个化合物中，以化合物1的活性最佳。进一步对化合物1进行研究可见，其能够明显上调抗病毒因子TNF-α的mRNA表达水平，并通过流式细胞仪检测证实。化合物1的给药剂量越大，抗病毒因子TNF-α的信号反应越强，表明化合物1对TNF-α的刺激效果与给药剂量有关。在信号通路调控机制研究过程中可见，化合物1对巨噬细胞的IKBα蛋白具有刺激作用，同时还能够上调p-p65蛋白的表达，并通过激活NF-κB信号通路来刺激抗病毒因子TNF-α的释放。

自我国引入辣木，并对其进行商业种植以来，各界学者对其化学成分、生物活性以及经济价值等方面的研究从未停止，且在各自领域取得了一定的研究成果[11-12]。辣木籽作为辣木树的种子，目前已被证实具有较高的医用价值[13]。本次研究仅对辣木籽化学成分和其对TNF-α的调控作用进行分析，但对其其他成分和生物活性未深入研究，对其是否具有多重作用机制也未进行探索。随着现代医学技术和科学技术的发展，相信未来对辣木籽的研究将更加深入，期待后续研究为辣木籽的开发提供更多理论依据。