新型反相球包球填料的纳流液相色谱行为研究

徐灵佳

(宁夏职业技术学院，银川 750021)

0 引言

纳流液相色谱现在已经成为生化分析中的重要分离手段，它的显著优势是高分辨、进样量小和高灵敏度。近些年兴起的核-壳色谱材料是分离科学的重要成就，它优化了色谱动力学过程，具有快速高效、背压较低的优点[1-2]。

纳流液相色谱中的色谱柱的尺寸均较小，它每分钟的流量是纳升级的。Chervet等人根据柱径将微柱液相色谱分为三类：色谱柱内径在0.5～1.0 mm被称为微流液相色谱(micro-LC)；色谱柱内径在100～500 μm被称为毛细管液相色谱(capillary-LC)；色谱柱内径在10～100 μm被称为纳流液相色谱(nano-LC)[3-5]。

色谱填料的结构和性质对于色谱分离影响深远，一直以来都是人们不断探索开发的课题。本实验采用的球包球填料是一种新型的壳核式反相色谱填料。它是通过调整硅前体、搅拌类型和速度、温度及微波加热等实验条件来调整反应速度，利用“一锅法”合成出的一种色谱填料。这种填料在常规高效液相色谱上具有很好地分离效果，具有快速、低背压的分离特点[6-8]。

1 实验部分

1.1 实验仪器

P230 高压恒流泵(依利特，中国)、TP-202电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司，北京)、Ultimate 3000 纳流液相色谱(Dionex，part of Thermo Fisher，USA)、日立S-4800扫描电镜(Hitachi，Japan)

1.2 材料与试剂

毛细管：内径100 μm，外径375 μm的透明涂层毛细管(永年锐沣色谱器件有限公司，河北)

柱塞：粒径为110 μm的球形硅胶颗粒(X-tec，UK)

溶剂：甲醇、乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)

样品：硫脲、苯的同系物(甲苯、乙苯、丙苯、丁苯)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、三氟乙酸(TFA)(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)

1.3 球包球填料毛细管柱的制备

1.3.1 填充单颗粒柱塞

毛细管柱管采用100 μm内径、365 μm外径的毛细管。截取适当长度的毛细管，用砂纸打磨一端，使其成为一个平整的切口，将一个110 μm的柱塞填充在切口平整的一端，并利用“基石效应”[9-10]保证柱床在后续的高压填充过程中不会被冲出。

1.3.2 匀浆法填充毛细管柱

将填料3 μm ODS-SOS配成匀浆，再使用高压泵将匀浆填入填好塞子的毛细管柱。填充过程中尽量保持匀浆匀速压入毛细管，使柱床匀速增长。

1.3.3 平衡毛细管柱

待柱床填充至所需长度后，继续使用高压将柱床压实。适当时间后，停止加压，让压力自然降为零，卸压后在所需位置截下毛细管，并在截下位置处填上一个110 μm的柱塞。用此方法填充三根15 cm长的ODS-SOS毛细管柱。

1.4 纳流液相色谱的分离分析

1.4.1 苯的同系物的配制

用超纯水配制1 mg/mL的硫脲，再将苯的同系物(甲苯、乙苯、丙苯、丁苯)用色谱纯乙腈以1∶100的配比稀释成溶液；将上述苯的同系物溶液与硫脲溶液充分混合，最后用所需缓冲液稀释10倍(本实验用50% ACN稀释)，配成样品待用。

1.4.2 纳流液相色谱体系流动相的配制

分别配制流动相。A相(水相)：H2O+0.1% TFA；B相(有机相)：ACN+0.1% TFA；C相：50%ACN。

1.4.3 等度洗脱

纳流液相色谱在适当的流速下，使用50%ACN作为流动相进行等度洗脱，分离苯系物。使用配置有3 nL流通池的紫外—可见可变波长的检测器在214 nm的波长下检测。

2 结果与讨论

2.1 球包球填料的扫描电镜

为了了解球包球填料微观结构对色谱分离效能的影响，团队使用了扫描电镜对球包球填料进行观察。

由图1可以看出，这种新型球包球填料的均一度较高，通过测量，粒径均为3 μm，这和之前报道的对于球包球填料粒径分布窄的描述一致[6-8]。填料中没有出现明显的小球脱落的现象，且包覆在微米球上的纳米球比较均匀，但表面团簇的小球凹凸不平，使得整个填料表面过于粗糙。在高压填充柱床时，这种随机性的凹凸不平可能会容易形成空气，增加多流路效应，导致涡流扩散项增加，从而影响色谱分离性能。

图1 球包球填料的扫描电镜图

2.2 球包球填料毛细管柱的分离与柱间重现性

本实验利用单颗粒柱塞技术填充球包球填料毛细管柱，并在纳流液相色谱上进行了分离，对柱间重现性进行了评价，分离样品为苯的同系物。

图2 三根15 cm长的球包球填料毛细管柱分离苯系物的对比图(SOS-ODS 3 μm，15 cm×100 μm，流动相：50%ACN，流速：150 nL/min分析物：硫脲、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯)

由图2可以看出，球包球填料的毛细管柱的柱间重现比较高，此结果说明单颗粒柱塞技术[9-10]可以成功制备球包球填料毛细管柱，并且毛细管色谱柱的重现性较好，这进一步验证了单颗粒柱塞技术的优越性。

2.3 球包球填料毛细管柱的范氏曲线

利用填充的球包球填料毛细管柱在纳流液相色谱中分离苯系物，对丁苯分离的塔片高度计算得出范氏曲线，绘制曲线得到图3。

图3 三根15 cm长的球包球填料范氏曲线对比图(SOS-ODS 3 μm，15 cm×100 μm，使用保留分析物[丁苯]作为标准，做范氏曲线)

本次实验中，球包球填料毛细管柱的最低塔板高度为22μm，分离时效果一般，这和之前报道的在常规柱内的行为不相符[6-8]。造成这一现象的原因可能是在纳流液相色谱条件下，色谱柱管径更细，背压更高，球包球填料表面微球结构更容易形成空腔，影响了分离效能。

3 结语

本实验利用单颗粒塞技术成功制备了球包球填料的纳流液相色谱微柱，实现了重现性和稳健性更高的分离，同时对球包球填料进行了简单表征，考察了球包球填料毛细管柱的在纳流液相色谱模式下的分离效能。球包球填料在范氏曲线上的表现一般，可能与其本身性质和加工工艺有关，后续还需要进一步优化。尽管如此，球包球填料的高度均一性依旧显示出它在色谱分离上具有很大的潜力。