基于网络药理学探讨补肾祛风法代表药对“益智仁-防风”在糖尿病肾病治疗中的有效成分及作用机制

芮 凯，王 献，赵靖宇，马天鹏，蒋 欢，杨 旭，谢毅强，李 凯

（海南医学院，海南 海口 571199）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最主要的微血管并发症之一，是目前引起终末期肾脏疾病（end-stage-renal-disease，ESRD）的主要原因［1］。根据流行病学统计研究，截止2019 年全球糖尿病患病人数约4.64 亿，到2045 年，糖尿病患者 人 数 预 计 将 超 过7 亿［2］。糖 尿 病 发 病10～20 年后，大约20%～40%患者会发展为DKD，最终进展为ESRD［3］。在慢性肾病中，DKD 致死率比例逐渐升高，DKD 已成为ESRD 的首位原因［4］。目前，西医治疗DKD 的主要策略是血糖、血压的控制和肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制，虽然近年来SGLT2 抑制剂等新药表现出DKD 的治疗作用，但其不良反应及恶化的肾终点事件限制了其临床运用［5］。

“补肾祛风法”是中医临床治疗DKD 的常用治法，由全国首届国医大师郭子光教授针对DKD“肾虚兼风”病机而确定的治法［6］。益智仁是海南地区的“四大南药”之一，其性温、味辛，入脾胃经，有温脾止泻、摄唾涎、暖肾、固精缩尿的功效。防风性微温，味辛、甘，入膀胱、肺、脾、肝经，有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效。“益智仁-防风”是补肾祛风法的代表性药对，能有效针对DKD 中肾虚兼风这一病机［7，8］。在团队的前期研究中，已经证实了益智仁治疗DKD 有效，如益智仁通过抑制炎性途径，保护肾脏功能、减少微量蛋白泄露、改善糖尿病病理改变等［9］，且证实其具体作用机制为介入NLRP3 炎症信号通路，抑制NLRP3 炎性因子表达从而减轻肾脏炎性反应［10］。本团队已通过药效实验证实了“益智仁-防风”治疗DKD 的有效性［11］，但其具体的有效成分及作用机制还需进一步的深入研究。

补肾祛风法是在中医整体观念指导下治疗DKD 的有效方法。基于补肾祛风法的药对“益智仁-防风”在治疗DKD 研究中，仍然存在药效物质基础不明确、作用机制不清楚，难以从整体到分子水平进行全面系统研究的问题。而网络药理学系统整体的研究思路中“多成分-多靶点-多通路”作用机制与中医整体观念、药物配伍增效理念相契合［12］。同时DKD 发病和较多因素有关［13］，基于网络药理学研究益智仁-防风药对“多成分-多靶点-多通路”的作用机制能够为“益智仁-防风”药对的应用和DKD 的治疗提供更多研究思路和方案。

1 资料与方法

1.1 分析益智仁、防风潜在活性成分的筛选及对应靶蛋白的查找

在中药数据平台中，分别以益智仁、防风为关键词检索其主要化合物成分，筛选指标为OB＞30%、DL＞0.18；并通过靶基因预测平台以combinescore≥0.5 筛选出有效靶点。

1.2 DKD 相关靶点筛选

在疾病靶基因数据库中，以Diabetic Kidney disease 为关键词，选择结合分数（Score gda）＞0.8 的蛋白作为特异性靶基因。

1.3 益智仁-防风与DKD 交集靶基因的筛选及通路预测

通过维恩分析对组分靶点和特异性靶基因进行分析，获得关键靶基因后通过蛋白质互作平台对其作用通路进行预测。

1.4 相关软件与数据平台

主要使用的中药成分及其预测数据库为：NPASS（http：/ /bidd2. nus.edu. sg/NPASS）、HIT（http：/ /lifecenter. biosino. org/hit/）、BATMAN-TCM（http：/ /bionet. ncpsb. org/batmantcm/）、TCMSP（http：/ /lsp. nwu.edu. cn/tcmsp. php）、PubChem（https：/ /pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）；主要使用的靶基因预测数据库为：STITCH（http：/ /stitch.embl.de/）、Swisstarget prediction（http：/ /swisstarget prediction.ch/）、TargetNet（http：/ /targetnet.scbdd.com）；主要使用的蛋白互作平台数据库为：STRING（https：/ /string-db.org/）、GeneMANIA（http：/ /genemania.org/）；DAVID（https：/ /david. ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.6.1（http：/ /www. cytoscape. org）、OMICshare（https：//www.omicshare.com/）被用来构建分析互作网络。

2 结果

2.1 防风、益智仁有效化学成分以及有效靶点筛选

利用中药数据平台（TCMSP 平台）查询防风、益智仁主要化合物成分。

2.1.1 （1）防风：二十五烷酸（Pentacosanoic acid）、香豆素类木质素类（2-［（2S）-7-oxo-2，3-dihydrofuro［4，5-g］chromen-2-yl］propan-2-yl（E）-2-methylbut -2-enoate）、十七烷类（heptadeca-1，8-dien-4，6-diyn-3，10-diol）、黄花菜木脂素（（2R，3R）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-5-methoxy-2-methylol-2，3-dihydropyrano［5，6-h］［1，4］benzodioxin-9-one）、白芷灵类（anomalin）、二芥子酸（divaricatacid）、11-hydroxysec-o-beta-d-glucosylhamaudol_qt、ledebouriellol，部分成分为查找到其确切中文名称，参考现有研究［14］后保留数据库中英文名称。

2.1.2 （2）益智仁：豆甾醇（stigmasterol）、胡萝卜甾醇（daucosterol）、谷甾醇（sitosterol）、谷甾醇棕榈酸酯（sitosterol palmitate）。

使用靶基因预测平台（STITCH、Swisstarget prediction、TargetNet）对有效化合物或类似物进行在线预测靶基因，设置条件combinescore≥0.5 筛选出有效靶点为124 个。

2.2 相关基因的挖掘

使用糖尿病肾病疾病靶基因数据库（OMIM、DisGeNET）检索已经确证报道收录数据库的靶蛋白，收集原始数据，选择得结合分数＞0.5 的蛋白作为特异性靶基因。获得靶点301 个，其中前10 个特异性靶基因详见表1。

表1 特异性靶基因列表Tab 1 Specificity targeted gene list

2.3 网络构建分析（富集）

将前两步筛选出的组分靶点和特异性靶基因进行维恩分析，获得关键靶基因36 个，其中包括MLK、MKK4、MEK1、MEK2、NF-kappaB、AKT、CDK2、HBXAP、NLK、MB、GSK3B、HLA-DPB1、PIK3R5、CDK6 等。

将筛选出的有效化合物靶点对应其所属化合物，构建关系对文件后录入Cytoscape 软件作图，进行Hub 分析后发现在筛选到的效化合物中，十七烷类（heptadeca-1，8-dien-4，6-diyn-3，10-dio）、二芥子酸（divaricatacid）等具有高连接度，可能为潜在的关键化合物，结果见图1。

图1 关键化合物Fig 1 Key compounds

收集共同基因数据导入蛋白质互作平台（STRING、GeneMANIA）提取互作关系对文件保存，录入Cytoscape 软件作图，进行Hub 分析后发现GSK3B、ILF2、STAT3、CDK1、ESR2、SHC1 等处于关联中心位置，可能为关键靶基因，见图2。

图2 关键靶基因Fig 2 Key target genes

2.4 基因富集分析

将获取的关键靶基因录入David 数据库关键基因GO 功能富集和KEGG 富集。排名靠前的主要相关信号通路如下：JNK、cell apoptosis、PBX3、ERK5 pathway 等。靶基因映射信号通路后，获得的结果富 集 通 过NF-kappaB 、classical MAP kinase、JNK and p38 MAP kinase、ERK5 等炎症或免疫途径发挥作用。见图3。

图3 关键通路Fig 3 Key pathways

3 讨论

补肾祛风法论治DKD 临床疗效确切。“肾虚”病机贯穿DKD 始终，DKD 肾虚的病机古代医籍已有记载，《金匮要略》载“男子消渴，小便反多，以饮一斗，小便一斗，肾气丸主之”，论述了DKD 肾虚病机导致口渴、小便频数等症。《圣济总录》载“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚寒，气化失常，开合不利，水液聚于体内，而出现水肿”，论述了DKD 肾虚病机导致水肿一症。DKD 具有肾虚的临床表现，现代医家统计了DKD 临床四诊信息［15］，其中神疲乏力、夜尿频多、畏寒肢冷、腰膝怕冷等均是肾虚的临床表现。DKD 病程中的蛋白尿与肾虚关系密切，朱侣等［16］认为蛋白是人体的精微物质，DKD 蛋白尿与肾失于封藏关系密切。王东等［7］认为肾虚贯穿本病的始终，肾虚精关不固是蛋白尿的重要成因，应将固肾涩精之药应用于本病的始终。“风”是DKD病机的重要部分。早在《素问》就已有因风邪导致肾病的论述。《素问·水热穴论》载“勇而劳甚，则肾汗出，肾汗出逢于风，内不得入于脏腑，外不得越于皮肤，客于玄府，行于皮里，传为腑肿，本之于肾，名曰风水”，论述了外风致肾病发生的机理，《素问·奇病论》载“帝曰：有病庞然如有水状，切其脉大紧，身无痛者，形不瘦，不能食，食少，名为何病？歧伯曰：病生在肾，名为肾风”。《素问·风论》载“肾风之状，多汗恶风，面庞然浮肿，脊痛，不能正立，其色火台，隐曲不利，诊在肌上，其色黑”，论述了肾风以浮肿为主的诸多临床表现。《金匮要略·水气病脉证并治第十四》载“脉浮而洪，浮则为风，洪则为气……风气相击，身体洪肿，汗出乃愈。恶风则虚，此为风水”。当代医家总结了风邪伤肾的辨证要点有面肿、外感肺经症状、尿沫多、伴风湿症状及发于冬春等［17］。黄学民等［18］观察发现DKD 常见皮肤瘦痒、疼痛走窜、头晕目眩、腿脚抽筋等风毒和内风的表现。风为阳邪，其性开泄，其性质与肾主封藏相反，风邪扰肾，使得肾脏封藏功能受损，蛋白尿是“风”的重要指征［8］。国医大师郭子光教授［19］亦提出“肺虚不能制下，肾虚不能封藏，风邪内扰于肾，则每见蛋白尿”。一项临床回顾性研究［20］通过Pearson 相关性分析也证实了DKD 风邪证要素积分与24 h 尿蛋白量呈正相关。

“益智仁-防风”是补肾祛风法的代表药对。现代研究发现［21，22］，益智仁的有效成分主要包括甾醇类、二苯庚烷类、黄酮类、酚类、醚类化合物及脂肪酸类等，具有抗氧化、抗过敏、神经保护、抗炎等药理作用；防风的有效成分主要包括色酮类成分、香都素类成分、酸性多糖、挥发油等，具有解热、抗炎、阵痛、抗过敏等药理作用。由上述可知基于补肾祛风法的“益智仁-防风”药对在DKD 的治疗中行之有效，但仍然存在药效物质基础不明确、作用机制不清楚，难以从整体到分子水平进行全面系统地研究，故而通过网络药理学对其治疗DKD 的有效成分、作用靶点、通路等进行预测分析。

本次通过中药数据平台筛选“益智仁-防风”药对的有效成分共有324 个靶蛋白。通过网络药理学分析从潜在活性成分与靶点相互作用关系网络图中可知“益智仁-防风”药对与DKD 关键靶基因有48个。通过对益智仁成分的研究，Li 等［23］发现益智仁提取物可以有效抑制大鼠尿量，同时大剂量的提取物可以增加K+排泄，Xie 等［24］通过对益智仁提取物的进一步研究发现其可以通过调节肠道菌群组成来降低小鼠血糖水平和肾脏病理损伤。陈益耀等［25］发现益智仁提取物中的原儿茶酸和白杨素可以通过抗氧化应激减少细胞内脂肪，对细胞具有保护作用。此外，也有不少学者对防风成分的作用进行研究。李丽等［26］已经证实防风色原酮类物质具有抗氧化作用。张泽庆等［27］证实防风多糖有较强的抗氧化活性，其中以酸性防风多糖效果最佳。钟才宁等［28］对防风挥发油进行提取并发现防风挥发油成分有一定的自由基清除能力和抗氧化作用。此外，李文等［29］的研究结果显示防风具有抗凝血、降低血浆浓度的作用。

通过基因富集预测，“益智仁-防风”药对主要可能通过NF-kappaB 、classical MAP kinase、JNK and p38 MAP kinase、ERK5 等 通 路 发 挥 对DKD 的 作用。在大黄素调节巨噬细胞极化的实验中，NFkappaB 通路能够被脂多糖诱导，在炎症级联瀑布反应中起关键作用［30］。JNK 通路在细胞增殖、转化、分化、凋亡等多种生理病理过程发挥着重要作用［31］。有学者利用姜黄素的类似物C66 高选择性地对JNK 通路进行抑制，从而在体内外实验中对DKD 起到良好的治疗作用［32］。陈玉凤［33］等在1 型糖尿病大鼠心肌作用机制研究中发现JNK 通路能够阻碍高糖诱导的NLRP3 蛋白表达。本团队在早期研究中也已经证实益智仁能够通过抑制NLRP3炎 性 途 径 对DKD 疾 病 起 到 作 用［10］。p38 MAP kinase 通路被证实对压力、缺氧、炎症等刺激敏感，能够参与到炎症、细胞分化、凋亡等多个过程［34］。另外，也有学者通过实验发现p38 MAP kinase 通路在炎症反应中起着重要的介导作用，在抑制p38 MAP kinase 通路后，可以通过减轻炎症反应从而减少尿蛋白以缓解DKD 进程［35，36］。刘雯霞［37］的研究结果显示在高糖高脂条件，抑制ERK5 通路能够缓解高糖诱导的细胞凋亡和纤维化。袁媛［38］通过动物实验，发现抑制ERK5 通路后，与空白组相比血栓形成时间推迟，证实了ERK5 通路对体内血小板凝聚发挥重要作用。

通过网络药理学的研究发现，基于补肾祛风法的“益智仁-防风”药对通过多成分、多靶点、多通路实现对DKD 的治疗，这与中医整体观念、药物配伍增效观念相同。当下，对“益智仁-防风”药对的研究多从单成分、单机制出发，而对其有效成分、作用通路、机制等尚未进行充分研究。本研究旨在通过网络药理学的预测，为基于补肾祛风法中的“益智仁-防风”药对在DKD 的治疗提供更多研究方案，并以此证实益智仁-防风治疗DKD 的部分机理，为后期“益智仁-防风”药对治疗DKD 研究提供新的思路和方法。

作者贡献度说明：

芮凯：完成了文中网络药理学部分的分析与撰写；王献：完成了讨论中相关综述内容的撰写；赵靖宇完成了本文英文摘要的撰写；马天鹏、蒋欢：完成了本文引言部分有关DKD流行病学的资料查找及撰写；谢毅强、杨旭：作为项目负责人完成对本篇论文的指导与审校；李凯：作为项目负责人完成了中医理论探讨部分的撰写及对该篇论文的审校。