药用昆虫凹纹胡蜂三氯甲烷部位化学成分研究

黄艳敏，庞秀琴，许静蕾，唐宋元，李勇鍵，杨志斌，肖 怀*

（1.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000；2.药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南大理 671000；3.中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用2011协同创新中心，云南大理 671000；4.大理大学药学院，云南大理 671000）

《神农本草经》最早记载了胡蜂类药材，将其列为上品，主治嗌痛、干呕、心腹胀满痛，久服轻身益气〔1〕。胡蜂亦作为传统民族验方，用于预防和治疗多种炎症引起的疾病。如景颇族验方胡蜂酒已被《中华人民共和国药典》所收录〔2〕；彝族医生习用胡蜂成虫、蜂巢、分泌物入药，用于祛风除湿、消肿止痛、攻毒杀虫〔3〕。胡蜂是一种益多害少的资源昆虫，其成虫、幼虫、蜂巢及蜂毒可药用、食用，还可用于生物防治〔4〕。近年来，越来越多的研究人员关注胡蜂的资源价值，对其蜂毒活性、营养成分、蛋白质含量、重金属、常微量元素、挥发性及脂溶性成分等进行了研究〔5-10〕。胡蜂基源众多，全国约200种，其中云南省分布154种〔11〕。开展系统深入的研究有利于胡蜂资源的可持续开发应用。凹纹胡蜂Vespa aurariaSmith的干燥成虫可入药，其性味甘、平、有毒，具有消肿解毒等功效，主要用于治疗风湿痹痛、痈肿疮毒、蜘蛛和蜈蚣咬伤等病症〔3〕。目前，关于凹纹胡蜂化学成分的研究还很少。本研究从凹纹胡蜂的三氯甲烷提取部位中分离鉴定出11个化合物，分别为：环（丙氨酸-脯氨酸）（1）、环（脯氨酸-脯氨酸）（2）、环（脯氨酸-甘氨酸）（3）、环（脯氨酸-酪氨酸）（4）、环（苏氨酸-脯氨酸）（5）、N-乙酰基异亮氨酸（6）、N-乙酰基-4-（4-羟基苯）乙胺（7）、烟酸（8）、1-甲基-1，2，3，4-四氢咔啉-3-羧酸（9）、3-吲哚乙酸（10）、（2R，3S）-2-（3'4'-dihydroxyphenyl）-3-acetylamino-7-（N-acetyl-2"-aminoethyl）-1，4-benzodioxane（11）。见图1。

图1 化合物1~11的化学结构

1 仪器与材料

Bruker AVⅢ-400型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Waters 2535制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Agilent 1260分析型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；EYELA循环冷凝泵（日本东京理化器械株式会社）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（美国GE Healthcare公司）；柱层析硅胶、薄层层析硅胶（青岛海洋化工有限公司）；氘代试剂（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色谱用洗脱溶剂分别为经过重蒸的工业纯溶剂或化学纯溶剂；展开剂所用溶剂均为分析纯，均购自天津风船化学试剂科技有限公司。

实验用凹纹胡蜂由云南省德宏傣族景颇族自治州芒市轩岗乡胡蜂养殖基地提供，大理大学昆虫生物医药研究院杨自忠教授鉴定为凹纹胡蜂Vespa aurariaSmith，标本保存于云南省昆虫生物医药研发重点实验室。

2 提取与分离

将32 kg凹纹胡蜂干燥成虫碾碎，用95%乙醇冷浸提取4次，混合提取液，减压浓缩至无醇味，加适量蒸馏水混悬后，用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。将三氯甲烷萃取液减压浓缩至干得到40 g浸膏，后将其进行硅胶（200~300目）柱层析，用石油醚-三氯甲烷（1∶0→0∶1）和三氯甲烷-甲醇（1∶0→5∶1）梯度洗脱，薄层色谱法检识，合并为8段（Fr.1~Fr.8）。Fr.3（14.3 g）经反复硅胶（200~300目）柱层析，以石油醚-丙酮溶剂系统梯度洗脱，得到9个组分Fr.3-1~Fr.3-9。Fr.3-9（0.8 g）通过半制备反相高效液相色谱（甲醇-水，5∶95→95∶5）梯度洗脱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱（氯仿-甲醇，1∶1），得到化合物1（79.0 mg）、化合物2（30.5 mg）。Fr.4（6.4 g）经反复硅胶（200~300目）柱层析，以三氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1）为洗脱剂进行等度洗脱，得到10个流分Fr.4-1~Fr.4-10。Fr.4-7（108.2 mg）采用半制备反相高效液相色谱，甲醇-水（5∶95→95∶5）梯度洗脱得到化合物7（13.4 mg）。Fr.4-8（114.2 mg）反复经硅胶柱色谱（300~400目）、半制备高效液相色谱（甲醇-水，5∶95→95∶5）和Sephadex LH-20凝胶柱色谱（甲醇）得到化合物6（6.2 mg）和化合物10（4.3 mg）。Fr.4-10（116.3 mg）经半制备反相高效液相色谱（甲醇-水，5∶95→95∶5），得到Fr.4-10-1~Fr.4-10-5。Fr.4-10-1（24.3 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（甲醇）反复等度洗脱得到化合物4（5.0 mg）、化合物5（4.5 mg）、化合物8（9.3 mg）。Fr.4-10-2（20.6 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（甲醇）等度洗脱得到化合物3（13.0 mg）。Fr.5（4.5g）经硅胶（200~300目）柱层析，以乙酸乙酯-甲醇（25∶1→0∶1）为溶剂系统梯度洗脱，得到20个组分，Fr.5-1～Fr.5-20。Fr.5-5（116.3 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（三氯甲烷-甲醇，1∶1）等度洗脱得到化合物11（22.1 mg）。Fr.6（1.85 g）采用半制备高效液相色谱（甲醇-水，5∶95→95∶5）梯度洗脱，得到化合物9（7.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末（氯仿），分子式为C8H12N2O2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.18-3.98（2H，m，Ala-H-2，Pro-H-2），3.64-3.42（2H，m，Pro-H-5），2.41-2.22（1H，m，Pro-H-3a），2.10-1.93（2H，m，Pro-H-4），1.91-1.81（1H，m，Pro-H-3b），1.42（3H，d，J=5.7 Hz，Ala-H-3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：170.9（Pro-C-1），166.6（Ala-C-1），59.3（Pro-C-2），51.2（Ala-C-2），45.5（Pro-C-5），28.2（Pro-C-3），22.8（Pro-C-4），15.8（Ala-C-3）。以上波谱数据与文献〔12〕报道基本一致，化合物1鉴定为环（丙氨酸-脯氨酸）。

化合物2：黄色粉末（甲醇），分子式为C10H14N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.35（1H×2，t，J=7.8 Hz，Pro-H-2，H-2'），3.62-3.41（2H×2，m，Pro-H-5，5'），2.39-2.21（2H×2，m，Pro-H-3，3'），2.14–1.86（2H×2，m，Pro-H-4，H-4'）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：168.6（Pro-C-1，C-1'），61.8（Pro-C-2，C-2'），46.3（Pro-C-5，C-5'），28.8（Pro-C-3，C-3'），24.3（Pro-C-4，C-4'）。以上波谱数据与文献〔13〕报道基本一致，鉴定化合物2为环（脯氨酸-脯氨酸）。

化合物3：白色粉末（甲醇），分子式为C7H10N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.23（1H，m，Pro-H-2），4.10（1H，brd，J=16.8，Gly-H-2a），3.73（1H，d，J=16.8 Hz，Gly-H-2b），3.53（2H，m，Pro-H-5），2.39-2.25（2H，m，Pro-H-3），1.95（2H，m，Pro-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：172.1（Pro-CO），166.5（Gly-CO），59.9（Pro-C-2），47.1（Pro-C-5），46.4（Gly-C-2），29.5（Pro-C-3），23.4（Pro-C-4）。以上波谱数据与文献〔14〕报道基本一致，化合物3鉴定为环（脯氨酸-甘氨酸）。

化合物4：白色粉末（氯仿），分子式为C14H16N2O3。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，d，J=8.4 Hz，Try-H-2'，6'），6.78（2H，d，J=8.4 Hz，Try-H-3'，5'），4.23（1H，dd，J=9.7，2.8 Hz，Try-H-2），4.09（1H，J=7.5 Hz，Pro-H-2），3.60（2H，m，Pro-H-5），3.46（1H，dd，J=14.5，3.9 Hz，Tyr-H-3a），2.78（1H，dd，J=14.5，9.9 Hz，Tyr-H-3b），2.33（1H，m，Pro-H-3a），2.01（1H，m，Pro-H-3b），1.92（2H，m，Pro-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：169.9（s，Pro-CO），165.4（Tyr-CO），155.8（Tyr-C-4'），130.5（Tyr-C-2'，6'），127.0（Tyr-C-1'），116.2（Tyr-C-3'，5'），59.3（Pro-C-2），56.4（Tyr-C-2），45.6（Pro-C-5），36.1（Tyr-C-3），28.5（Pro-C-3），22.6（Pro-C-4）。以上波谱数据与文献〔15〕报道基本一致，化合物4鉴定为环（脯氨酸-酪氨酸）。

化合物5：黄色油状液体（氯仿），分子式为C9H14N2O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.36（1H，dt，J=7.0，3.5 Hz，Thr-H-2），4.10（1H，m，Pro-H-2），3.71（1H，brs，Thr-OH），3.53（2H，m，Pro-H-5），2.35（1H，m，Pro-H-3a），2.10（1H，m，Pro-H-3b），2.03（1H，m，Pro-H-4a），1.91（1H，m，Pro-H-4b），1.34（3H，d，J=6.6 Hz，Thr-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：170.3（Thr-C-1），165.5（Pro-C-1），65.7（Thr-C-3），59.5（Pro-C-2），59.1（Thr-C-2），45.4（Pro-C-5），28.2（Pro-C-3），22.8（Pro-C-4），19.1（Thr-C-4）。以上波谱数据与文献〔16〕报道基本一致，化合物5鉴定为环（苏氨酸-脯氨酸）。

化合物6：白色粉末（甲醇），分子式为C8H15NO3。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：4.05（1H，d，J=5.8 Hz，H-2），1.86（3H，s，H-2′），1.79-1.67（1H，m，H-3），1.27（2H，ddd，J=12.1，7.3，4.5Hz，H-4），1.05（3H，dt，J=13.8，7.5 Hz，H-6），0.79-0.67（3H，m，H-5）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：176.1（C-1），174.1（C-1'），58.0（C-2），36.1（C-3），24.5（C-4），21.4（C-2'），14.8（C-6），10.6（C-5）。以上波谱数据与文献〔17〕报道基本一致，化合物6鉴定为N-乙酰基异亮氨酸。

化合物7：白色固体（甲醇），分子式为C10H13NO2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.02（2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6），6.70（2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5），3.35（2H，t，J=2.5 Hz，H-8），2.68（2H，t，J=7.4Hz，H-7），1.90（3H，s，H-2'）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：173.4（C-1'），157.1（C-4），131.4（C-1），130.9（C-2，6），116.4（C-3，5），42.6（C-8），35.8（C-7），22.7（C-2'）。以上波谱数据与文献〔18〕报道基本一致，化合物7鉴定为N-乙酰基-4-（4-羟基苯）乙胺。

化合物8：白色粉末（氯仿），分子式为C6H5NO2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.05（1H，s，H-2），8.77（1H，s，H-6），8.21（1H，s，H-4），7.44（1H，dd，J=7.9，4.9 Hz，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：169.6（C-7），152.7（C-6），148.3（C-2），135.9（C-4），129.3（C-3），123.9（C-5）。以上波谱数据与文献〔19〕报道基本一致，化合物8鉴定为烟酸。

化合物9：淡黄色粉末（甲醇），分子式为C13H14N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.42（1H，d，J=7.8 Hz，H-5），7.28（1H，d，J=8.1 Hz，H-8），7.07（1H，t，J=7.6 Hz，H-7），6.98（1H，t，J=7.5 Hz，H-6），4.13（1H，d，J=6.6 Hz，H-1），3.92（1H，dd，J=12.1，5.0 Hz，H-3），3.43-3.31（1H，m，H-4a），3.02-2.90（1H，m，H-4b），1.68（3H，d，J=6.7 Hz，H-10）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：138.8（C-8a），131.8（C-9a），127.5（C-4b），123.4（C-7），120.7（C-6），119.3（C-5），112.4（C-8），107.9（C-4a），59.7（C-3），51.2（C-1），24.4（C-4），17.2（C-10）。以上波谱数据与文献〔20〕报道基本一致，化合物9鉴定为1-甲基-1，2，3，4-四氢咔啉-3-羧酸。

化合物10：白色粉末（甲醇），分子式为C10H9NO2。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.42（1H，d，J=7.9 Hz，H-8），7.32（1H，d，J=8.1 Hz，H-7），7.18（1H，d，J=6.2 Hz，H-2），7.14-7.03（1H，m，H-5），6.98（1H，t，J=7.4 Hz，H-6），3.56（2H，s，H-10）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：178.3（-COOH），136.0（C-8），128.5（C-9），124.8（C-2），121.9（C-5），119.3（C-6），118.1（C-4），111.7（C-7），107.4（C-3），39.5（C-10）。以上波谱数据与文献〔21〕报道基本一致，化合物10鉴定为3-吲哚乙酸。

化合物11：淡黄色粉末（甲醇），分子式为C20H22N2O6。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.85（1H，d，J=1.7 Hz，H-2'），6.82（1H，s，H-6），6.80（1H，d，J=2.0 Hz，H-5'），6.75（1H，s，H-8），6.74（1H，d，J=1.8Hz，H-5），6.72（1H，d，J=1.9 Hz，H-6'），5.68（1H，d，J=7.0，5.2 Hz，H-3），4.68（1H，d，J=7.0 Hz，H-2），3.29（2H，t，J=7.2 Hz，H-2''），2.64（2H，t，J=7.3 Hz，H-1''），1.91（3H，s，CH3），1.87（3H，s，CH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：173.3（CO），173.2（CO），147.1（C-4'），146.4（C-3'），144.2（C-8a），142.1（C-4a），134.1（C-7），128.7（C-1'），123.2（C-6），120.5（C-6'），118.0（C-8），117.9（C-5），116.0（C-5'），115.5（C-2'），78.3（C-2），78.2（C-3），42.1（C-2''），35.7（C-1''），22.6（CH3），22.5（CH3）。以上波谱数据与文献〔22〕报道基本一致，化合物11鉴定为（2R，3S）-2-（3'，4'-dihydroxyphenyl）-3-acetylamino-7-（N-acetyl-2''-aminoethyl）-1，4-benzodioxane。

4 讨论

本研究对凹纹胡蜂的化学成分进行研究，从三氯甲烷部位分离鉴定出11个化合物，均为首次从该药用昆虫中分离得到，其中包括5个环二肽类化合物（1~5）。环二肽是由两个氨基酸通过脱水缩合形成肽键环合而成，是一种重要的生物活性分子，其骨架是比较稳定的六元含氮杂环，含两个氢键受体、两个氢键供体〔23〕。许多环二肽具有抗菌、抗癌、镇痛、抗感染、抑制毒素生成等生物活性〔24〕。化合物11属于多巴胺类二聚体，在该昆虫提取物较大极性的乙酸乙酯萃取部位也分离到了多个类似成分。此类化合物普遍存在于昆虫体内，种类较多，部分化合物含量也比较高，其生物活性、种间差异等有待进行深入研究探讨。