不同电针频率对抑郁样小鼠认知功能的影响*

谢彦颖 刘亮生 陈进东

抑郁症(Depression)作为目前常见的精神疾病之一，主要临床表现为情绪低落、愉快感缺失、乏趣、自卑、自责、意志活动减退等症状，有的患者也会伴有幻觉、妄想等精神类症状，抑郁症对个人认知能力、社会功能、生活质量造成深远负性影响[1,2]。认知缺陷是抑郁症的特征之一，研究表明抑郁症患者在认知加工速度、注意力广度、记忆力和执行功能方面都有损害[3,4]。同时抑郁症也是阿尔茨海默病的一个危险因素[5]，可能是阿尔茨海默病的前兆[6]。电针作为针灸的主要衍生方式，在临床中已经被证实能够对抑郁症有着较好的疗效[7]，同时对认知功能损伤的恢复有积极的作用[8-10]。虽然有报道不同的电针参数对认知能力的恢复有不同的影响[11,12]，但尚未有关于不同电针频率对抑郁症及其认知功能的影响的研究报道。本研究从认知的角度，选择连续波中不同频率的电针参数观察电针对抑郁样小鼠抑郁样行为及认知功能的影响，探讨电针治疗抑郁症认知功能的最优电针参数。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组SPF级雄性C57/BL6小鼠60只，7周龄，体质量18～22 g，购于浙江维通利华实验技术有限公司[生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001]。实验小鼠饲养于厦门市仙岳医院精神卫生研究室，饲养环境：每笼4只小鼠，温度22～25 ℃，湿度50%～55%，12 h/12 h明暗时长，自由饮食饮水。实验小鼠适应性饲养1周后，随机区组分为对照组(Ctrl=12只)、模型组(CUMS=12只)、模型+2 Hz电针组(2 Hz=12只)、模型+15 Hz电针组(15 Hz=12只)、模型+100 Hz电针组(100 Hz=12只)。实验过程中对动物的处置严格遵照中华人民共和国科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[13]，所有实验由厦门市仙岳医院实验动物管理伦理委员会进行监督与管理(2021-KY-001)。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂①氯化钠(美国，SIGMA.S7653-1KG)；②碳酸氢钠(美国，SIGMA.S5761-500G)；③蔗糖(美国，SIGMA.V90016)；④氯化钾(美国，SIGMA.P9333-1KG)；⑤二水合氯化钙(美国，SIGMA.C5080-500G)；⑥葡萄糖(美国，SIGMA.G7021-1KG)；⑦二水合磷酸二氢钠(美国，SIGMA.71500-1KG)；⑧硫酸镁(美国，SIGMA.M2643-500G)；⑨人工脑脊液(Artificial Cerebrospinal Fluid,ACSF,250 ml)：120.0 mM氯化钠，2.5 mM氯化钾，1.2 mM二水合磷酸二氢钠，2.0 mM硫酸镁，2.0 mM二水合氯化钙，26 mM碳酸氢钠，10 mM葡萄糖；pH7.35～7.45，渗透压290～310 mOsm。

1.2.2 电针治疗相关设备①针灸针(中国，中研太和，0.16 mm×7 mm)；②Master-9(以色列，A.M.P.Instruments LTD.7733)；③小动物麻醉机(中国，瑞沃德，R58S)。

1.2.3 行为学检测相关设备动物行为学视频分析系统(美国，Stoeling，ANY version 4.99 m)。

1.2.4 电生理检测相关设备及耗材①震动切片机(德国，徕卡，VT1000S)；②膜片钳CCD(日本，尼康，ECLIPSE FN1)；③膜片钳显微镜(日本，尼康，OFN22 WD30)；④数模转换器(美国，MD，Axon Digidata 1550B)；⑤数字放大器(美国，MD，Axon Multi Clamp 700B)；⑥微电极拉制仪(美国，Sutter，P-1000)；⑦恒温水浴锅(中国，南京舜玛仪器设备有限公司，SM8D)；⑧玻璃微电极(美国，Sutter，BF100-50-10)；⑨异氟烷(中国，瑞沃德，R510-22)。

1.3 模型制备模型组与电针组实验动物采用慢性温和性不可预见性应激(Chronic Unpredictable Mild Stress, CUMS)方法制备抑郁模型[14]，造模连续3周，期间小鼠每天随机给予不同应激，包括：①24 h禁食；②24 h禁水；③2 h束缚；④7 h笼子倾斜；⑤夜间照明；⑥24 h脏笼饲养(每100 g垫料加水200 ml)；⑦8 ℃水中强迫游泳30 min；⑧24 h暴露在异物中(如塑料)。造模期间给予对照组小鼠常规方式饲养，不进行应激。

1.4 干预方法造模后，电针组小鼠进行电针干预，使用5%异氟烷诱导麻醉后使用2%异氟烷维持麻醉。小鼠麻醉后，俯卧位置于保温垫上，参照《实验针灸学》[15]选取百会穴、印堂穴，采用0.16 mm×7 mm一次性针灸针，百会穴与印堂穴向后斜刺2 mm，连接master-9进行电针治疗，选用连续波，电流1 mA，相应分组分别采用2 Hz、15 Hz、100 Hz的电针频率，每次治疗时间30 min，每周治疗6 d，连续治疗3周。对照组与模型组进行相同方式的麻醉，不电针。

1.5 指标检测

1.5.1 行为学检测行为学检测前，将实验小鼠提前2 h转运至小动物行为学室进行适应，行为学室为隔音室，湿度、温度同小鼠饲养环境。

糖水偏好实验(Sucrose Preference Tests, SPT)[14]：小鼠单笼饲养，首先训练动物消耗来自2个不同瓶子的1%蔗糖溶液(正式实验前48 h)。24 h后，允许动物自由接触来自2个不同瓶子的1%蔗糖溶液和水。为避免位置偏爱，12 h后将2个瓶子位置互换。24 h后测量两瓶中的液体量，并根据以下公式计算蔗糖偏好：蔗糖偏好=蔗糖消耗量/(蔗糖+水消耗量)×100%。

悬尾实验(Tail Suspension Tests, TST)[14]：将小鼠的尾巴悬挂在丙烯酸棒上6 min(直径1.5 cm，高30 cm)，并使用视频跟踪系统进行监控。记录6 min内的不动持续时间，分析后5 min的实验数据。每只小鼠结束实验后均用10%乙醇进行清理小鼠排泄物，消除气味对其他小鼠的影响。

强迫游泳实验(Forced Swimming Tests, FST)[14]：小鼠放置在一个装有水(23±1)℃深13 cm透明丙烯酸圆柱桶中(直径10 cm，高20 cm)。使用视频跟踪系统将小鼠放入水中6 min；记录测试的最后5 min内的不动持续时间。

Morris水迷宫实验(Morris Water Maze Task)[16]：为了评估学习和记忆，实验小鼠进行为期5 d的 Morris水迷宫任务测试。水迷宫装置由直径120 cm，高50 cm，水深40 cm 的圆柱形水箱和连接计算机的摄像机组成。水箱分为4个象限，平台(直径10 cm)放置在第三象限，距离水面1 cm。在定位导航训练过程中，将一只老鼠从每个象限的等距位置放入水中4 d。当一只老鼠在90 s内停留在平台上超过3 s时，这个时间将被记录为该象限老鼠的逃避潜伏期。如果老鼠在90 s内没有找到平台，它就会被从水中取出，放在平台上进行15 s学习。第5天是测试实验，调查记忆的巩固。平台被移走，老鼠被放在第一象限，记录每只小鼠的游泳轨迹。

跳台回避实验(Step-down Avoidance Test)[16]：在Morris水迷宫任务测试之后进行跳台回避测试，将小鼠放入实验箱(20 cm×20 cm×60 cm)的圆柱形隔热平台中，适应周围环境3 min。当老鼠走下平台时会立即接受2 s电刺激(电压32 V，电流0.25 A)，训练时间5 min。训练后24 h，记录潜伏期(第1次下台)和错误次数(跳台次数)，记录时间5 min。

1.5.2 电生理检测脑片制备：0～4 ℃ ACSF通入95%O2+5%CO2混合气体30 min，小鼠经异氟烷麻醉后快速取脑放入0～4 ℃ ACSF中，使用震动切片机将小鼠大脑切至400 μm厚的脑片，34 ℃ ACSF孵育30 min，室温孵育1 h后进行记录。ACSF全程通入上述混合气体。

长时程增强记录(Long-term Potentiation，LTP)[17]：使用同心圆电极刺激 SC-CA1通路，3～5 MΩ的玻璃电极内部装入ACSF，电流钳记录 CA1局部的场电位(field EPSPs, fEPSPs)。刺激参数100 μs的恒定电流脉冲，频率为0.033 Hz，强度为最大振幅的30%左右，时间为1 s。通过测量fEPSPs的斜率来确定突触传递的强度。记录刺激前10 min基线及刺激后60 min的fEPSPs。

2 结果

2.1 各组小鼠抑郁样行为学比较与对照组(Ctrl)相比，模型组(CUMS)表现出典型的抑郁样表现：糖水偏好减少，悬尾与强迫游泳中的静止时间增多(图1A、1B、1C，P<0.01)；与模型组(CUMS)相比，2 Hz电针治疗能够明显改善小鼠抑郁样行为：糖水偏好增加，悬尾与强迫游泳中的静止时间减少(图1A、1B、1C，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的电针治疗只能改善部分抑郁样行为(图1B，P<0.01)。见图1。

注：A图：在糖水实验中，CUMS组小鼠对糖水的偏好明显降低，而2 Hz较15 Hz、100 Hz的电针治疗能够更为明显改善小鼠对糖水的偏好；B图：在悬尾实验中，CUMS组小鼠静止的时间明显增长，而电针能够有效减少小鼠的静止时间，其中2 Hz的电针参数效果最好；C图：在强迫游泳实验中，CUMS组小鼠静止的时间明显增长，只有2 Hz的电针能够有效减少小鼠静止的时间。*P<0.05，**P<0.01，n=12只/组。

2.2 各组小鼠认知行为学比较与对照组(Ctrl)相比，模型组(CUMS)有明显的认知功能损伤：Morris水迷宫的潜伏期缩短，跳台规避实验中的潜伏期延长、错误次数增多(图2A、2B、2C、2D、2E，P<0.01)；与模型组(CUMS)相比，2 Hz电针治疗能够明显改善小鼠认知功能：Morris水迷宫的潜伏期缩短，跳台规避实验中的潜伏期延长、错误次数减少(图2A、2B、2C、2D、2E，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的电针治疗只能改善部分认知功能：Morris水迷宫的潜伏期缩短(图2A、2B、2C，P<0.01)；15 Hz的电针治疗也能够减少跳台规避实验中的错误次数(图2E，P<0.05)。见图2

注：A图：各组小鼠水迷宫实验代表性例图；B图、C图：水迷宫实验中，CUMS组小鼠的潜伏期明显延长，而电针能够有效减少小鼠的潜伏期，其中2 Hz的电针参数效果最好；D图、E图：在跳台回避实验中，CUMS组小鼠的潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，只有 2 Hz的电针能够有效延长小鼠潜伏期。*P<0.05，**P<0.01，n=12只/组。

2.3 各组小鼠LTP比较与对照组(Ctrl)相比，模型组(CUMS)的LTP明显受损(图3A、3B、3C，P<0.01)；与模型组(CUMS)相比，2 Hz电针治疗能够显著改善小鼠受损的LTP(图3A、3B、3C，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的电针治疗也能够明显改善小鼠受损的LTP(图3A、3B、3C，P<0.05)。见图3。

注：A图：各组小鼠LTP代表性例图；B图、C图：CUMS组小鼠的LTP受损最严重，而电针能够有效减少小鼠LTP受损情况，其中2 Hz的电针参数效果最好。*P<0.05，**P<0.01，n=8脑片/3只/组。

3 讨论

抑郁症的发病机制纷繁复杂，至今尚不明确，除了与遗传因素密切相关外，心理社会因素是其另一主要发病因素[18]。慢性不可预见性温和刺激(CUMS)作为应激的一种主要模式被广泛应用于抑郁症、焦虑症等精神心理疾病模型中，通过不同的应激方法作用于小鼠可以获得比较稳定的抑郁症样小鼠模型[19]。抑郁样小鼠行为主要表现在糖水偏好的降低、悬尾实验和强迫游泳实验的不动时间延长、新环境进食抑制实验潜伏期延长等方面[19]。

虽然抑郁症是以情绪低落、兴趣减退、快感缺失为主要症状，但越来越多的研究报道抑郁症患者的认知功能有不同程度的损伤[20]，并且认知功能的损伤在老龄抑郁症患者中表现得更加明显[21]，因此有学者认为抑郁症是老龄痴呆的一大危险因素[22]。

百会穴位于督脉之上，而督脉入络脑，脑为诸阳之会，且百会穴位于巅顶，其下为脑，故百会具有调和机体阴阳、调节情志活动、醒脑开窍、安神定志等功效。印堂穴位于面部两眉头之间，其内为额叶，因其隶属于督脉，故与脑联系密切，因此印堂、百会穴一脉相通，可调督醒神。现代研究表明选用百会穴、印堂穴能够对脑内的单胺类神经递质、谷氨酸、γ-氨基丁酸等神经递质有不同的调节作用[23]，同时研究报道，电针“印堂”“百会”两穴可使脑内5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素的含量增加，改善抑郁[24]。

针灸/电针在改善认知功能障碍方面有明显的疗效，针刺联合药物治疗对阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease, AD)患者的短期和中期认知功能比单独用药有明显的改善作用[9]，同时针灸有利于改善老年人的轻度认知功能障碍[10]。基础实验研究表明，电针百会穴能显著提高 APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力，上调N-乙酰天冬氨酸、谷氨酸和肌醇代谢，增加海马存活神经元，促进BDNF和TrkB的表达[15]。LTP是发生在2个神经元信号传输中的一种持久的增强现象，由于记忆被认为是通过突触强度的改变来编码的，因此LTP 被广泛认为是构成学习和记忆基础的主要细胞机制之一[25,26]，血管性痴呆(Vascular Dementia，VD)大鼠的LTP受损明显，针灸可增强VD大鼠海马体中的LTP和去甲肾上腺素水平从而改善VD大鼠的认知功能[27]。

本实验研究发现，CUMS后的小鼠表现出糖水偏好减少、悬尾实验与强迫游泳实验的不动时间延长等典型的抑郁样行为，同时也有水迷宫实验与跳台规避实验中的潜伏期延长、LTP受损等认知功能障碍的表现，而2 Hz电针干预在改善小鼠的抑郁样行为和认知功能障碍方面效果突出，15 Hz、100 Hz电针干预则只能够部分改善小鼠的抑郁样行为及认知功能。

4 结论

本实验的研究结果表明，在选用连续波的情况下，2 Hz电针治疗不仅能够有效改善小鼠抑郁样行为，同时能够明显改善抑郁样小鼠的认知功能；15 Hz、100 Hz电针治疗只能够部分改善小鼠的抑郁样行为及认知功能，其中15 Hz的疗效优于100 Hz。