miR-29a-3p与ELN在早产儿支气管肺发育不良患儿中的表达意义

许花芬，冯 琼，李春蕾

(海南省人民医院海南医学院附属海南医院新生儿科，海口 570311)

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)大多数发生于胎龄<32周的早产儿，其发病不利于早产儿预后[1-2]。寻找BPD早期标志物进行诊断并干预，有利于降低发病率和致残率。微RNA(microRNA，miR)-29a可抑制靶基因mRNA翻译，从而对其发挥转录后调控作用[3]。弹性蛋白(elastin，ELN)可为各血管壁细胞提供骨架结构，与心血管疾病发生有关[4]。ZHONG等[5]研究显示，BPD小鼠肺组织中miR-29a-3p表达上调，ELN表达下调，但目前仍缺少miR-29a-3p、ELN在BPD早产儿血清中的表达研究。因此，本研究通过检测不同时间点血清miR-29a-3p、ELN的表达水平，探讨二者在BPD早产儿中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2021年7月本院新生儿科收治的131例早产儿为研究对象。纳入标准：(1)所有BPD早产儿符合BPD诊断标准[6]，其诊断要点为：低出生体重，早产，超过21%的氧气治疗至少28 d或纠正胎龄36周仍需氧气治疗，伴有进行性或持续性呼吸功能不全，有明显肺部影像学表现；(2)胎龄≤32周、体重≤1 500 g，存活28 d以上者；(3)早产儿病历资料齐全，研究符合伦理标准，经家长同意，并签署同意书。排除标准：(1)有其他严重肺部疾病者；(2)有严重肺外感染者；(3)有先天性心脏病、先天性畸形、先天性代谢紊乱者。根据BPD诊断标准将其分为BPD组(34例)和非BPD组(97例)。

1.2 方法

1.2.1资料采集

收集整理两组胎龄、性别、出生体重、剖宫产、机械通气时间、吸氧时间、最高氧浓度、院内感染等一般资料。

1.2.2血清miR-29a-3p、ELN水平检测

采集两组早产儿出生后第1、7、14天静脉血标本，分离血清，保存备用。采用RNA提取试剂盒(北京康瑞纳生物科技有限公司)提取血清总RNA，检测浓度后逆转录试剂盒(定州百克赛斯生物科技有限公司)将其逆转录为目标cDNA。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-29a-3p水平，反应体系：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Hieff qPCR SYBR®Green Master Mix(2×，上海翌圣生物科技股份有限公司)10 μL，Rox reference dye(50×，上海经科化学科技有限公司)0.4 μL，无核酸酶的水6.0 μL。选用U6为内参基因，采用2—ΔΔCT法计算血清miR-29a-3p相对表达水平。所用引物委托美国Invitrogen公司合成，miR-29a-3p上游引物5′-GTA TCC GGT GAG TCC AAG CGC-3′，下游引物5′-GCT AGA CAG ATC CCA GTA C-3′；U6上游引物5′-CAT GAT GCA CGG CAA AGC ATC-3′，下游引物5′-GTA ATT ACC CGT CTC CGT GTC-3′。采用ELISA法检测血清ELN水平(试剂盒购自武汉益普生物科技有限公司)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组一般资料比较

与非BPD组比较，BPD组机械通气时间、吸氧时间更长，最高氧浓度、院内感染率更高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较

续表1 两组一般资料比较

2.2 两组不同时间点血清miR-29a-3p、ELN水平比较

早产儿出生后第7、14天，BPD组miR-29a-3p相对表达水平高于非BPD组，ELN低于非BPD组，差异有统计学意义(P<0.05)。随着时间推移，BPD组miR-29a-3p相对表达水平逐渐上升，ELN水平逐渐下降，不同时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组不同时间点血清miR-29a-3p、ELN水平比较

2.3 BPD组miR-29a-3p、ELN水平与一般资料的相关性

Pearson法及Spearman法分析结果显示，BPD组早产儿出生后第7天miR-29a-3p与ELN水平呈负相关(P<0.05)，且机械通气时间、吸氧时间、最高氧浓度、院内感染与miR-29a-3p呈正相关，与ELN呈负相关(P<0.05)，见图1、表3。

2.4 miR-29a-3p、ELN水平对早产儿BPD的预测价值

以是否发生BPD为状态变量绘制ROC曲线，结果显示，早产儿出生后第7天miR-29a-3p、ELN及其联合预测BPD发生的AUC分别为0.863(0.773，0.953)、0.878(0.819，0.937)、0.949(0.905，0.993)，且联合预测AUC均大于miR-29a-3p、ELN单独预测AUC(Z=1.687、1.908，P<0.05)，灵敏度分别为76.5%、82.4%、94.1%，特异度分别为89.7%、79.4%、86.6%，见图2。

2.5 影响早产儿BPD发生的多因素logistic回归分析

将早产儿是否发生BPD作为因变量，多因素logistic回归分析结果显示，miR-29a-3p、ELN是早产儿BPD发生的独立影响因素(P<0.05)，见表4。

图1 BPD组miR-29a-3p与ELN水平相关性

表3 BPD组miR-29a-3p、ELN与一般资料的相关性分析

图2 血清miR-29a-3p、ELN水平预测早产儿BPD的ROC曲线

表4 影响早产儿BPD发生的多因素logistic回归分析

3 讨 论

早产儿肺部慢性疾病BPD的发病率呈上升趋势，且严重威胁早产儿生命安全[7]。研究显示，机械通气相关因素均是引起BPD发生的危险因素，机体长时间的高氧暴露，使体内氧化和抗氧化系统平衡被打破，体内氧化应激反应会导致肺组织的结构和功能出现异常[8]。实现BPD早期预测是改善早产儿肺功能发育的重要前提。

miR已被证实与BPD的发病机制有关，miR-29家族的miR-29a下调可减轻BPD小鼠的肺损伤、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[9-10]。本研究结果显示，随时间推移，BPD早产儿血清miR-29a-3p水平逐渐上升，ELN水平逐渐下降，miR-29a-3p、ELN表达趋势与ZHONG等[5]动物模型实验结果一致。此外，HU等[3]研究中抑制miR-29a可减轻高氧诱导的新生小鼠BPD，与本研究结果中miR-29a-3p与BPD的关系基本一致。推测本研究中血清miR-29a-3p水平上升后对靶基因ELN发挥转录后调控作用，抑制其翻译成蛋白，使其在肺组织中的弹性支架作用减弱，造成肺部发育不良，推动BPD的发生。此外，本研究相关性结果考虑可能是由于部分BPD早产儿出生后长时间暴露于机械通气及高氧环境中，造成肺部反复感染，而肺部感染可能会引起血清miR-29a-3p表达水平升高，miR-29a-3p负调控ELN使其表达降低，影响肺部发育、造成肺损伤，而肺损伤又使吸氧时间、机械通气时间延长，形成恶性循环，促进BPD的发生、发展。NDZI等[11]研究发现，与健康对照组相比，活动性肺结核患者中hsa-miR-29a-3p明显上调，进一步证明了血清miR-29a-3p表达水平与肺部感染的关系。

本研究ROC曲线分析结果显示，血清miR-29a-3p、ELN联合预测BPD的AUC、灵敏度有明显升高。结合多因素分析结果，推断血清miR-29a-3p、ELN表达水平的良好调节可能是预防及改善BPD发生、发展的新策略。DENG等[12]研究显示，异常肺泡形成和过度紊乱的ELN积聚也可能是BPD的主要病理特征。表明ELN过度表达和积聚同样不利于支气管肺发育，今后仍需进一步探究ELN在支气管肺发育中的平衡状态。

综上所述，miR-29a-3p、ELN是BPD发生的影响因素，检测早产儿血清miR-29a-3p、ELN表达水平可早期预测BPD发生。今后将扩大样本量，探究机械通气、吸氧时间等是否影响miR-29a-3p、ELN表达水平。