嗜热芽孢杆菌SL-2产生物乳化剂的研究

王雅洁，梁绮雯，杨芳芳

（广州卫生职业技术学院，广东广州 510450）

生物乳化剂是指一种由细菌新陈代谢所产生的表面活性化合物，一般是蛋白质、多糖、脂蛋白、脂多糖中的一种或是几种的复合体所组成的生物表面活性剂[1]。生物乳化剂具有稳定界面膜的作用，能与石油烃等物质形成稳定的油水乳化液，没有毒害作用，可以进行生物降解，是一种环境友好型材料，目前在石油开采、污染治理、农药开发、化妆品以及食品等领域具有广阔的发展前景[2-3]。

嗜热芽孢杆菌SL-2是从中国胜利油田油井中分离的一株细菌，这种菌株可以进行原油乳化，是目前生物乳化剂研究实验中的热门菌株之一。其在高温（60 ℃）条件下能正常生长代谢，且乳化烃类物质的效果优越。因此，开展该菌株生长及烃类乳化特性的研究，可以为该菌进一步应用于微生物驱油奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 菌株

SL-2菌株来自中国胜利油田油井。

1.1.2 实验仪器

HPX-Ⅱ-200隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；FTIR-650S傅里叶变换红外光谱仪，天津港东科技发展股份有限公司；EM-30AX扫描电子显微镜，韩国COXEM公司；3K15低温高速离心机，德国Sigma公司；IMARK酶标仪，美国BIORAD公司；UV-1800紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；X50梯度PCR仪，德国Master cycler；L-8800氨基酸自动分析仪，日本日立公司；电泳仪，Sub-Cell GT水平电泳槽，美国Bio-Rad公司；Tanon 3500胶成像仪，上海天能科技有限公司；VM100漩涡振荡仪，北京托摩根生物科技有限公司；FD-1A-50冷冻干燥仪，北京博医康实验仪器有限公司。

1.1.3 实验试剂

蔗糖，10021418，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖，10010518，国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖，CAS 9012-36-6，阿拉丁试剂（上海）有限公司；酵母粉，LP0021，英国OXOID公司；蛋白胨，LP0042，英国OXOID公司；甲苯，C0430110209，南京化学试剂有限公司；二甲苯，C0430530209，南京化学试剂有限公司；Na2HPO4，10020318，国药集团化学试剂有限公司；KH2PO4，10017618，国药集团化学试剂有限公司；NH4NO3，A117717-1 g，阿拉丁试剂（上海）有限公司；MgSO4·7H2O，M200，美国phytotech公司；柴油，南京德茗化工科技有限公司；煤油，南京德茗化工科技有限公司；液体石蜡，南京德茗化工科技有限公司；SDS，南京圣比澳生物科技公司。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 培养基

种子培养基：酵母粉3.00 g/L，蛋白胨3.00 g/L，K2HPO4·4H2O 2.70 g/L，NaCl 5.00 g/L。

MSS培养基：NaCl 10.00 g/L，蔗糖10.00 g/L，Na2HPO45.00 g/L，KH2PO42.00 g/L，NH4NO33.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L。

1.2.2 培养条件

在固体培养基MSS中选出一株单菌落，然后接种到培养基里，在250 mL的三角杯中加入约50 mL的菌液，在60 ℃、130 r/min条件下培养12 h。以5%（v∶v）转接量将种子孵化液转接到培养基里，在250 mL三角杯中添加约50 mL的细菌水，以60 ℃、130 r/min的条件振荡培养。

1.3 目的菌株的鉴别

（1）通过肉眼观察目的菌株的生长形态、颜色、外观的粗细程度等，并用电子显微镜观察目的菌株的外观和构造。（2）通过16S rDNA测序解析鉴定目的菌株的种类以及属性。

1.4 乳化剂的分离提取与纯化

（1）将培养液在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心20 min，倒出上清液；

（2）抽滤（上清液），滤膜孔径标准尺寸为0.22 μm；

（3）将滤液与事先在4 ℃冰箱中预冷的冰乙醇以1∶3（v∶v）的比例混合，置于4 ℃冰箱中过夜；

（4）经沉淀后的滤液于4 ℃、8 000 r/min的条件下离心20 min，在分离出的沉淀物中加入去离子水使其充分溶解，并将其放于透析袋于4 ℃冰箱透析48 h后，随后进行冷冻干燥操作，得到白色絮状物质，储存于-20 ℃的环境中。

1.5 乳化活性的测定

将生物柴油与发酵液及萃取物按1∶1（v∶v）混合，涡旋振荡60 s，静置48 h以乳化指数（EI）表征乳化剂的乳化活性。乳化指数的计算公式：乳化指数=乳化层高/油相总高。

1.6 生物乳化剂定性实验

（1）糖类定性实验：在硅胶板上轻轻点样，晾干后，将硫酸-蒽酮溶液均匀喷洒在硅胶板上，然后放入120 ℃烘箱加热2～5 min，使其显示出颜色，若在硅胶板上出现蓝绿色即可证明样品中存在糖类。

（2）蛋白质定性实验：在硅胶板点样品后，晾干，用0.1%茚三酮溶液快速润湿后放入110 ℃烘箱中加热15 min显色。用茚三酮显色后都呈现出和阳性对照相似的黄色，说明该乳化剂中含有蛋白质组分。

（3）脂类定性实验：在硅胶板上点样，吹干，将其放入展层缸中，待展开剂前部距离硅胶板顶端大约1 cm时，取出硅胶板，在通风橱内晾干，均匀展铺显色剂后将其置于110 ℃烘箱中加热5～10 min，观察颜色是否发生改变，如果出现紫红色即可证明样品中存在脂肽类物质。展开剂：氯仿/甲醇/水（65/15/2，v/v/v）；将0.2 g的茚三酮溶放入100 mL乙醇溶液中，脂肽显紫红色。

1.7 乳化剂组分分析

1.7.1 乳化剂的红外光谱分析

将样品与溴化钾混合置于在研钵中磨碎，制作压片，上机扫描。

1.7.2 乳化剂的氨基酸分析

乳化剂样品经过6 mol/L HCl水解12 h后进行氨基酸组成分析。使用HITACHI L-8800型氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析，操作过程参照仪器使用说明。

1.7.3 蛋白质电泳

蛋白质定量方法：通过SDS-PAGE电泳检测，使蛋白分离原理是凭借其蛋白分子量亚基不同，在样品介质和Acrylamide gel中加入离子去污剂和强还原剂后，亚基分子量大小决定蛋白质亚基电泳迁移速率。使用考马斯亮蓝染色。

1.8 乳化剂的性质研究

1.8.1 乳化剂对不同底物的乳化作用

以甲苯、二甲苯、煤油、生物柴油和液蜡等为主要乳化对象，测试计算发酵液和离心去菌体的上清液的EI值。

1.8.2 乳化剂的稀释性能

将乳化剂样品溶解在重蒸水中，并逐级稀释到原液浓度的1/1、1/2、1/4、1/6和1/10，以柴油为有机相，静置72 h后测定其乳化活性，EI-72。

1.8.3 乳化剂酸敏性

取乳化的试样混合为乳状液，并分别测其在pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的环境下乳化活性，EI-24。

1.8.4 温度对乳化剂的影响

将与乳化剂和柴油充分接触形成的乳状液分别置于 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和 95 ℃下，放置 24 h后再测定其EI-24。

1.9 数据分析

将筛选得到的高温菌株进行DNA的提取后，利用细菌16SrDNA基因通用引物来扩增16SrDNA基因序列，序列在GenBank中用BLAST比对。

2 结果与分析

2.1 目的菌株的鉴别

由图1可知，菌株SL-2呈棒杆状形态，且其外层有一层透明物质，该物质可能是由多糖荚膜组成的。根据16SrDNA的测序结果，登陆https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，将其结果在GenBank中用BLAST比对，得出菌株SL-2与Geobacillus pallidus.的同源性为100%。

图1 菌株SL-2的扫描电镜图

2.2 生物乳化剂定性实验

2.2.1 菌株SL-2发酵液的乳化活性

菌株SL-2在以葡萄糖为碳源时可以产生一种生物乳化剂，该乳化剂的乳化活性随着菌株的生长有所变化。在生产乳化剂培养基发酵过程中，发现表面张力略有下降，发酵5 h乳化活性达到100%；72 h后，乳化液可以稳定在2个月以上。发酵液对0#柴油的EI-24为100%。菌株SL-2在培养基中培养24 h后，经离心、抽滤、沉淀、冻干的步骤，可获得乳化剂的产量为0.362 g/L。

2.2.2 乳化剂样品的薄层分析

采用薄层定性分析法可以对试样中的化学组成进行研究，该试验的基本原理是采用具有差异的特异性显色剂方法。将酸水解后所得的试样用毛细管在点样或有机硅板上点样，喷洒硫酸-蒽酮溶液后呈出现蓝绿色，这一显色颜色反应现象可以证实乳化剂试样中含有葡萄糖类成分；用茚三酮显色的水解物试样呈现淡淡橙色，而水解后的乳化物试样呈现紫黄色，这一颜色变化现象表明乳化试样中存在含有蛋白质。乳化剂样品经过薄层色谱法茚三酮显色后呈出现紫红色，说明乳化剂样品中含有脂类物质。通过对特异性显色法颜色反应的薄层定性分析可以证明，菌株SL-2所产生的乳化剂化学组成主要包括糖、脂类和蛋白质（肽）[4]。

2.2.3 乳化剂的红外光谱分析

将菌株SL-2所产的乳化剂试样用溴化钾压片后在400～4 000 cm-1波数下扫描[5]，结果如图2所示。该乳化物于1 065 cm-1、1 548 cm-1、1 651 cm-1、2 935 cm-1和3 314 cm-1处存在特征性吸收峰。其中，吸收峰（1 065 cm-1）是由C—O伸缩振动产生，吸收峰（1 548 cm-1）是由糖环上的C—O—C伸缩振动产生，吸收峰（1 651 cm-1）是酰胺键上羰基的特征吸收峰，（1 651 cm-1）是糖类C—H伸缩振动的特性吸收峰，而吸收宽峰（3314 cm-1）是由O—H的伸缩振动而形成。从菌株SL-2所产乳化剂的红外光谱可发现，该物质中存在较多-OH和RCO-NHR基团，且上述基团都是糖蛋白的特征官能团，因此能够最终判断糖类和蛋白质都是该乳化剂的主要化学组成。

图2 菌株SL-2产生的生物乳化剂的红外光谱分析

2.2.4 乳化剂的氨基酸分析

乳化剂样品经酸水解12 h后进行氨基酸组成分析。其中，极性氨基酸有7种，分别是Thr、Asp、Glu、His、Ser、Arg和 Lys，约为乳化剂总量的13.74%；非极性氨基酸有10种，分别为Ile、Val、Cys、Met、Ala、Tyr、Leu、Gly、Pro 和 Phe，约为乳化剂总质量的14.01%。

2.2.5 乳化剂的蛋白质分析

由图3可知，条带颜色较亮的是26.0 kDa和 66.4 kDa大小蛋白质，证明乳化剂中含上述两种大小的蛋白质比较多，其余蛋白质条带颜色很浅证明含量少甚至没有，实验证明生物乳化剂含有的蛋白质种类较单一，因此还需要进一步验证才能确定生物乳化剂中活性蛋白的成分。

图3 蛋白质电泳图

2.3 乳化剂理化性质分析

2.3.1 乳化剂对不同底物的乳化作用

本实验选取的乳化对象分别为甲苯、二甲苯、煤油、柴油和液蜡，分别测试发酵液和上清液的乳化能力。结果发现，发酵液对甲苯、二甲苯、柴油和煤油的EI-24均为100%，对液蜡的乳化效果仅为76%；上清液对二甲苯和柴油的EI-24为 100%，但对甲苯、煤油和液蜡的乳化能力有所降低，其中对液蜡的EI-24只有25%。证明菌株SL-2产生的乳化剂对不同的石油烃具有不同的乳化效果，同时也说明菌株本身对石油烃也有一定的乳化效果。

2.3.2 乳化剂的稀释特性

与原液浓度一致时，其EI-72为100%；当乳化剂浓度为原液浓度的1/2时，其EI-72仍大于90%；当溶液中乳化剂的浓度为原液浓度的1/10时，其EI-72依然大于30%，优于已报道的一些生物乳化剂的乳化效果[4-5]。说明菌株SL-2所产生乳化剂在极微量条件下就可以乳化石油烃，是一种高效生物乳化剂。

2.3.3 乳化剂的酸敏性

当乳化剂溶液的pH值为3～9时，其EI-24均为100%；当pH值在10～12时，乳化活性略有下降。说明菌株SL-2产生的乳化剂具有较好的耐酸能力。

2.3.4 温度对乳化剂活性的影响

乳状液的破乳程度随着放置温度的增加而增加，在60 ℃高温生长环境下形成的生物乳化剂特性非常稳定，温度低于80 ℃时，EI-24仍为100%；当放置温度为 95 ℃时，其EI-24仍大于40%，说明菌株SL-2产生的乳化剂具有一定的耐高温性质。

图4 温度对菌株SL-2乳化活性的影响

3 结论

本实验对苍白地芽胞杆菌SL-2所产的生物乳化剂进行了分离纯化及化学组分分析，发现该生物乳化剂由糖类、脂类和蛋白质组成；对其所产生物乳化剂的理化性能进行分析，结果显示菌株SL-2在60 ℃高温生长环境下形成的生物乳化剂性质稳定，证实了菌株SL-2是一株能够适用于中高温油藏的原位生物驱油菌种，并有着很重要的科研价值。但目前对该菌株生产生物乳化剂的机制尚不清楚，因此研究该菌株合成乳化剂的代谢途径和调控机制将是笔者未来的研究方向与重点。