正交实验优选白凤菜总黄酮提取工艺

郑晓艳

（漳州卫生职业学院 药学系，福建漳州 363000）

白凤菜为菊科（Compositae）菊三七属（Gynura）多年生草本植物白凤菜（GynuraformosanaKitam.）的全草，别名白担当，俗名肝炎草，其地上部分在福建特别是闽南民间被广泛应用，常作为消除各种炎症、养护肝脏的民间草药，是极具研究和开发价值的天然中草药。白凤菜性凉、味甘淡、无毒，入肝、肺、肾、大小肠等经，具有解热、解毒等功效[1]。目前对白凤菜的研究集中在药理活性方面，对白凤菜质量评价体系和提取工艺研究的文献较少。

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗肝脏毒性、抗心脑血管疾病、抗炎、抗氧化、降血糖等[2]。黄酮类化合物是白凤菜的主要活性成分之一，其提取量可作为白凤菜活性成分提取工艺优劣对比的一个重要指标[3]。

本研究通过单因素、正交实验对白凤菜总黄酮提取工艺进行优化，拟制定出操作便捷、重现性好的白凤菜总黄酮提取工艺方案，为将来进一步开发利用白凤菜提供重要实验参考。

本文中白凤菜总黄酮提取量的测定方法参考《中国药典》及各类文献，选用了简便、快捷、准确度高的金属离子络合法——NaN02-Al(N03)3-Na0H络合法，可以普遍应用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TU-1810型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；CP225D型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；R206型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；100SP型恒温数显水浴锅，上海申生科技有限公司。

白凤菜药材采摘于福建漳州市芗城区，经鉴定为菊科菊三七属白凤菜的地上部分。

1.2 实验方法

1.2.1 白凤菜前处理

将采摘的白凤菜晾晒、40 ℃烘干至恒重，称取20.0 g，加150 mL石油醚，索氏提取器中水浴加热回流至提取液无色，彻底挥发石油醚，晾晒至干燥，保存待用。

1.2.2 标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品0.108 4 g，用60%乙醇溶解并定容至50 mL，即得216.8 μg/mL的芦丁标准品溶液。精密吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL芦丁标准品溶液，分别置于25 mL容量瓶中，各加入0.3 mL 5%亚硝酸钠、0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，静置6 min，再各加入1 mol/L的氢氧化钠溶液5 mL，60%乙醇定容至刻度，摇匀后静置5 min，于510 nm处测定吸光度值[5]。以吸光度对浓度进行线性回归，并求得回归方程。

1.2.3 单因素实验

（1）乙醇浓度。精密称取前处理后白凤菜20 g，分别选择20%、40%、60%、80%和100%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比（g∶mL）为1∶20，90 ℃水浴提取1 h，提取2次，过滤除去药渣，合并滤液，于65 ℃真空蒸发浓缩，检测含量并计算提取量。

假定波浪载荷引起砂质海床孔隙水的渗流满足达西定律，渗透系数为常数，海床为各向同性介质。基于比奥动力固结方程，海床的控制方程为：

（2）料液比。精密称取前处理后白凤菜20 g，以60%乙醇为提取溶剂，料液比（g∶mL）分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，90 ℃水浴提取1 h，提取2次，过滤除去药渣，合并滤液，于65 ℃真空蒸发浓缩，检测含量并计算提取量。

（3）提取时间。精密称取前处理后白凤菜20 g，以60%乙醇为提取溶剂，料液比（g∶mL）为1∶20，90 ℃水浴提取 1.0 h、2.0 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h，提取2次，过滤除去药渣，合并滤液，于65 ℃真空蒸发浓缩，检测含量并计算提取量。

（4）提取次数。精密称取前处理后白凤菜20 g，以60%乙醇为提取溶剂，料液比（g∶mL）为1∶20，90 ℃水浴提取1 h，分别提取1次、2次、3次、4次、5次，过滤除去药渣，合并滤液，于65 ℃真空蒸发浓缩，检测含量并计算提取量。

1.2.4 正交实验

据单因素实验结果，以白凤菜中总黄酮提取量为考察指标，设计L9(34)正交实验，如表1所示。

表1 白凤菜总黄酮L9(34)正交实验因素水平表

1.2.5 白凤菜总黄酮提取量测定

将单因素实验和正交实验得到的白凤菜总黄酮用60%乙醇定容至50 mL，振摇均匀后静置；精密移取1.0 mL试液于25 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠、0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，静置6 min，再各加入1 mol/L的氢氧化钠溶液5 mL，以60%乙醇定容至刻度，振摇均匀，静置5 min，在510 nm波长处测定吸光度值，根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的含量，结果换算为白凤菜干基含量（mg/g）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

如图1所示，以测得的吸光度值对浓度进行线性回归处理，求得回归方程为Y=0.011 8X+0.004 1，R=0.999 9，线性范围 8.672～ 60.704 μg/mL。

图1 芦丁标准曲线

精密度实验RSD=0.24%，重复性实验RSD=0.69%，稳定性实验RSD=0.35%，证明该实验操作方法精密度、重复性、稳定性均良好。平均加样回收率98.1%，RSD=0.8%，说明该方法准确度良好。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇浓度对提取量的影响

经查阅文献及前期预实验，选择成本低廉、安全无毒、易得、易回收的乙醇作为提取溶剂。乙醇溶度过小，会导致水溶性（蛋白质、多糖等）成分析出过多，抢占了总黄酮溶出空间，且蛋白质和多糖易使提取液黏稠，总黄酮易被吸附；乙醇浓度过大则脂溶性成分更易析出，白凤菜中一些水溶性黄酮类成分提取不完全，也会导致总黄酮的提取量较低。

从图2可以看出，乙醇浓度对白凤菜总黄酮提取量的影响较大，在20%～60%内，随着乙醇浓度增加，白凤菜总黄酮提取量快速上升；当乙醇浓度大于60%后，增速开始趋于平稳，甚至乙醇浓度超过80%后，白凤菜总黄酮提取量有降低趋势。故选择乙醇浓度为40%、60%、80%进行正交实验。

图2 乙醇浓度对白凤菜总黄酮提取量的影响

2.2.2 料液比对提取量的影响

从图3可以看出，料液比对白凤菜总黄酮提取量的影响不大，虽然提取量随着料液比减小略有上升，但总体平缓。考虑到溶剂过少时不能完全浸没药材，且提取溶剂的用量过少，料液与药材的有效成分浓度差过低，这两方面均会导致总黄酮提取不完全，故溶剂不能过少。溶剂过多成本也随之提高，考虑到提取成本，选择1∶10、1∶20、1∶30为正交水平。

图3 料液比对白凤菜总黄酮提取量的影响

2.2.3 提取时间对提取量的影响

白凤菜总黄酮提取量在1～3 h随着提取时间的延长而增加；但当外界溶剂未更换时，药材组织内外有效成分浓度差逐渐减少，直至达到内外浓度平衡物质几乎不再溶出，继续延长提取时间不仅不能增加白凤菜总黄酮提取量，反而导致有效物质被破坏。故选择提取时间为1 h、2 h、3 h进行正交实验。

图4 提取时间对白凤菜总黄酮提取量的影响

2.2.4 提取次数对提取量的影响

如图5所示，提取次数从1次增加到2次，白凤菜总黄酮提取量大幅增加，提取次数为3次及以上后，提取量增长明显趋于平缓，表示白凤菜中的总黄酮已大部分被提取出。考虑到增加提取次数会导致人员成本、能源消耗增加，故选择提取次数为1、2、3次进行正交实验。

图5 提取次数对白凤菜总黄酮提取量的影响

2.3 正交实验结果

白凤菜总黄酮提取量正交实验结果如表3所示，方差分析结果如表4所示。

表4 正交实验结果

表5 白凤菜总黄酮提取工艺的方差分析表

从K值分析可知，最优组合为A2B3C1D3，从正交结果看，最优组合为A2B3C1D2。由单因素实验结果图可以看出，提取次数从1次增加到2次，白凤菜总黄酮提取量大幅增加，提取次数大于2次后，提取量增长明显趋于平缓，对提取量影响很小，结合工业生产成本，多提取一次所得量少，但能源、人工等消耗显著增加，故白凤菜总黄酮的提取次数确定为2次。从白凤菜总黄酮提取工艺的方差分析表可知，对白凤菜总黄酮提取量的影响大小顺序为乙醇浓度＞提取时间＞提取次数＞料液比。其中，提取时选用的乙醇浓度对白凤菜总黄酮的提取量具有显著影响（P＜0.05）。因此，综合各因素考虑白凤菜总黄酮最佳提取工艺为选用浓度为60%乙醇溶液提取，料液比1∶30（g∶mL），每次提取1 h，每份提取2次。

2.4 工艺验证

为验证该白凤菜总黄酮提取工艺的效果，按上述优选的工艺进行提取，平行操作3份，分别计算总黄酮提取量。结果显示，最优工艺下，白凤菜总黄酮平均提取量为23.7 mg/g，RSD为0.86%，说明该提取工艺稳定、可行。

3 结论

本研究采用正交实验优选得到白凤菜总黄酮提取量影响因素大小顺序为乙醇浓度＞提取时间＞提取次数＞料液比。优选出的白凤菜总黄酮提取工艺为：选用60%乙醇提取，料液比1∶30（g∶mL），每次提取1 h，每份提取2次。在此最佳提取工艺条件下，白凤菜总黄酮平均提取量为23.7 mg/g，RSD为0.86%，说明该提取工艺稳定、可行。