阿胶产品质量研究

张金龙，张玉玮，李广华，张明娟

（聊城市检验检测中心，山东聊城 252000）

阿胶始载于《神农本草经》，现收载于《中华人民共和国药典》（2020年版，以下简称新版《药典》）一部“阿胶”项下，规定“阿胶为马科动物驴Equus asinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶”[1]。阿胶作为中药材应用于临床疾病的治疗，还能制成食品、保健品增强人体免疫力。目前，市场上的阿胶产品有阿胶块、阿胶粉、阿胶糕、阿胶膏、阿胶口服液和阿胶枣等，阿胶产品因其特有的养生保健功效而深受欢迎。市场需求持续增长，阿胶的价格也节节攀升，有不法分子为牟利掺杂牛、马、骡、猪等杂皮制作假阿胶，甚至用工业废料制胶，致使阿胶质量存在较大风险，药品及食品安全性受到威胁。因此，新版《药典》加强了对特征多肽含量的测定，以加强对药品阿胶的质量控制。2019年，山东阿胶行业协会发布了《阿胶》（T/SDEJ 01—2019）、《阿胶糕》（T/SDEJ 02—2019）两项团体标准，以改变阿胶糕质量标准低、部分检测指标缺乏专属性、难以对杂皮造假和掺假的现象进行有效检测和监管的现状[2-5]。2021年3月，山东省开展风险监测阿胶专项，本次风险监测以药品阿胶、阿胶珠检验为主，同时对保健食品阿胶及阿胶糕的产品质量进行随行检查，探讨新标准执行以来阿胶产品质量的控制情况。

1 材料与方法

1.1 实验样品

专项抽检共收到阿胶样品67批（其中药品阿胶41批，来自全省4个地级市，涉及生产企业9家；阿胶珠9批，来自全省2个地级市，涉及生产企业3家；食品（保健食品）阿胶17批，来自全国3省4市，涉及生产企业12家）；收集市售阿胶糕样品19批。

1.2 试剂

甲酸、乙腈均为色谱纯，Adamas（上海）有限公司；磷酸，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶，序列分析级，德国Sigma公司；L-羟脯氨酸对照品（111578-200201）、甘氨酸对照品（140689-201103）、丙氨酸对照品（104680-201002）、L-脯氨酸对照品（140677-201206）、阿胶对照药材（121274-201904）、新阿胶对照药材（121745-201701）、黄明胶对照药材（121695-201301）、龟甲胶对照药材（121693-201702）、牛皮特征肽A对照品（111941-201804）、马源寡肽A对照品（112035-201702），中国食品药品检定研究院；铅镉砷汞铜混合对照溶液（610014-201701），中国食品药品检定研究院。

1.3 仪器

Triple Quad 5500+高效液相色谱质谱联用仪，配备Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），美国AB SCIEX公司；AB-135S电子天平，瑞士Mettler公司；Memmert-HPP260恒温恒湿箱，美国Merk Millipore公司；Milli-Q Integral超纯水仪，美国Merk Millipore公司；2695高效液相色谱仪，配备Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国Waters公司；7900电感耦合等离子体质谱仪，美国Agilent公司。

1.4 实验方法

药品阿胶按照新版《药典》一部“阿胶”项下规定进行检验。食品阿胶及阿胶糕按照《阿胶》（T/SDEJ 01—2019）、《阿胶糕》（T/SDEJ 02—2019）两项团体标准进行检验。探索性研究参考《阿胶中猪皮源成分检查项补充检验方法》（BJY 201917）、《阿胶中牛皮源含量的补充检验方法》（2012001）和《阿胶中铬（Cr）含量检查的补充检验方法》（20110122）。

1.4.1 性状

正常光线和室温条件下，目测其组织形态、色泽，嗅其气味，品尝其滋味。

1.4.2 鉴别

（1）色谱-质谱条件：乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，进样量5 μL；梯度洗脱方式：0 min，95%B；25 min，80%B；40 min，50%B；0.3 mL/min。电喷雾离子化（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）。检测离子对m/z分别为539.8（双电荷）→612.4和539.8（双电荷）→923.8。

（2）样品处理：取样品粉末或阿胶对照药材0.1 g，加1%碳酸氢铵溶液50 mL，超声处理30 min，用微孔滤膜过滤；取续滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL（取序列分析用胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成1 mg/mL的溶液，临用时配制），摇匀，37 ℃恒温酶解12 h。

1.4.3 检查

（1）水分。取待检样品1 g，精密称定，加水2 mL，加热溶解后置水浴上蒸干，使厚度不超过2 mm，按照“水分测定法”要求进行测定。

（2）重金属及有害元素。采用电感耦合等离子体质谱仪测定中药中的铅、砷、镉、汞、铜元素，仪器条件：射频功率为1 500 W；采样深度为8.0 mm；等离子体气流量为15 L/min；辅助气流量为1.0 L/min；载气流量为1.0 L/min；样品提升速率为1.0 mL/min；采用定量分析模式。

（3）标准品溶液制备：用10%硝酸溶液稀释铅、砷、镉、铜标准品贮备液，制成每1 mL含铅、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng和 20 ng，含镉 0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5.0 ng 和 10.0 ng，含铜 0 ng、50 ng、100 ng、200 ng和500 ng的系列浓度混合溶液。另精密量取汞标准品贮备液适量，用10%硝酸溶液稀释制成每1 mL分别含汞 0 ng、0.2 ng、0.5 ng、1.0 ng、2.0 ng、5.0 ng的溶液。

（4）供试品溶液制备：精密称取样品粗粉，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸5～10 mL，密闭并按消解程序进行消解、定容。

1.4.4 阿胶氨基酸含量测定

（1）色谱条件：乙腈-0.1 mol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值至6.5）（体积比7∶93）为流动相A，乙腈-水（体积比4∶1）为流动相B；进样量5 μL；梯度洗脱方式：0 min，0%B；11 min，7%B；13.9 min，12%B；14 min，15%B；29 min，34%B；30 min，100%B。

（2）对照品溶液制备：加0.1 mol/L盐酸溶液配制成每1 ml分别含L-羟脯氨酸80 μg、甘氨酸0.16 mg、丙氨酸70 μg、L-脯氨酸0.12 mg的混合溶液。

（3）供试品溶液制备：精密称定样品粗粉0.25 g，置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液20 mL，超声30 min，冷却至室温后加0.1 mol/L盐酸溶液定容。精密量取2 mL超声后溶液于5 mL安瓿瓶中，加盐酸2 mL，150 ℃水解1 h，冷却至室温后移至蒸发皿中；分多次加入10 mL水洗涤，洗液并入蒸发皿中蒸干，残渣加0.1 mol/L盐酸溶液溶解，转移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液定容。

（4）衍生化：精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各5 mL，分别置25 mL量瓶中，各加0.1 mol/L异硫氢酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5 mL和l mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，摇匀，室温放置1 h后加50%乙腈至刻度，摇匀。取10 mL溶液加正己烷10 mL，振摇后放置10 min，取下层溶液，过滤后续滤液即为色谱进样液。

1.4.5 特征多肽含量测定

（1）除检测离子对外，其他色谱-质谱条件同1.4.2（1）。以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线。从标准曲线读出供试品溶液中相当于驴源多肽A1（LPT A1）和驴源多肽A2（LPT A2）的量进行计算。

（2）对照品溶液制备：取驴源多肽A1对照品、驴源多肽A2对照品适量，精密称定，加1%碳酸氢铵溶液制成每1 mL含2.5 μg的混合溶液。精密量取对照品溶液1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL和25 mL，分别置50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，制成标准曲线溶液。

（3）供试品溶液制备：精密称定样品粉末0.1 g于50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，加1%碳酸氢铵溶液定容。精密量取l mL超声后溶液至5 mL量瓶中，加l mL胰蛋白酶溶液（用1%碳酸氢铵溶液制成1 mg/mL的溶液），加1%碳酸氢铵溶液定容，37 ℃恒温酶解12 h，过滤后取续滤液。

1.4.6 杂皮源筛查

（1）除检测离子对外，其他色谱-质谱条件同1.4.2（1）。利用马源寡肽A、新阿胶对照药材及牛皮特征肽A分别检查是否混有马（骡）源、猪皮源及牛皮源成分[2-3,6-7]。

（2）阿胶样品溶液制备：取样品粉末0.1 g，加1%碳酸氢铵溶液50 mL，超声处理30 min，过滤后取续滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL，37 ℃恒温酶解12 h。

（3）阿胶糕样品溶液制备：称样品5.0 g于50 mL容量瓶中，加水并超声至充分溶解，用水稀释至刻度，制得试样悬浊液。取10 mL试样悬浊液于3 000 r/min离心5 min，取离心后的清液5 mL，缓缓加入等体积的30%三氯乙酸溶液，充分振荡混匀，4 ℃静置20 min，8 000 r/min离心5 min，弃上清，用2 mL冷丙酮洗涤沉淀，8 000 r/min离心5 min后弃丙酮清液；再用2 mL丙酮重复洗涤并弃去丙酮清液，室温放置10 min挥干丙酮，制得阿胶提取物。

向阿胶提取物中加入1%碳酸氢铵溶液超声溶解，将溶液移入25 mL容量瓶内并用1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度。吸取溶液过0.22 μm滤膜，取400 μL续滤液，加40 μL胰蛋白酶溶液，混匀，37 ℃恒温酶解12 h，制得待测液。

1.4.7 铬含量检测

（1）标准溶液的制备：精密量取铬标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释成每1 mL含铬0 ng、0.125 ng、0.250 ng、0.500 ng、2.500 ng、5.000 ng、10.000 ng的系列浓度样品。

（2）样品制备及检验方法同1.4.3（2）[8]。

2 结果与分析

2.1 性状结果

按照新版《药典》一部对41批药品阿胶、9批阿胶珠进行性状检验，按《阿胶》（T/SDEJ 01—2019）对17批食品（保健食品）阿胶进行性状检验，按照《阿胶糕》（T/SDEJ 02—2019）对19批阿胶糕进行性状检验[1-3]。结果表明，41批药品阿胶、9批阿胶珠、17批食品(保健食品)阿胶和19批阿胶糕的性状均符合规定。典型样品性状见图1。

图1 典型阿胶产品形状

2.2 鉴别结果

按照1.4.2所述实验方法鉴别样品。结果表明，所有药品阿胶及阿胶珠样品均呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰，4批食品（保健食品）阿胶未检出与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰，8批阿胶糕未检出与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰。对照药材色谱峰图见图2。

图2 阿胶对照药材监测离子对LC-MS图

2.3 检查

2.3.1 水分测定结果

按照新版《药典》规定，阿胶水分≤15.0%，阿胶珠水分≤10.0%[1]。实验结果表明，药品阿胶水分10.8%～14.7%，食品（保健食品）阿胶水分9.4%～13.5%，阿胶珠水分1.4%～6.8%；67批样品全部符合规定。

2.3.2 重金属及有害元素测定结果

新版《药典》规定，阿胶产品中铅、镉、砷、汞和铜的含量分别不超过5.0 mg/kg、0.3 mg/kg、2.0 mg/kg、0.2 mg/kg和20.0 mg/kg。实验结果表明，药品阿胶（含阿胶珠）中铅的含量为0.005～0.963 mg/kg，镉的含量为0.001～0.011 mg/kg，砷的含量为0.014～0.124 mg/kg，汞的含量为0.0001～0.0035 mg/kg，铜的含量为0.2～2.0 mg/kg；食品（保健食品）阿胶中铅的含量为0.005～0.238 mg/kg，镉的含量为0.001～0.010 mg/kg，砷的含量为0.027～0.416 mg/kg，汞的含量为0.000 2～0.023 5 mg/kg，铜的含量为0.3～16.4 mg/kg；67批样品全部符合规定。

2.4 阿胶氨基酸含量测定结果

氨基酸混合对照品溶液及供试品溶液的液相色谱图见图3，10.402 min、12.368 min、16.105 min和16.747 min的色谱峰分别对应羟脯氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸和甘氨酸。标准规定，按干燥品计算，阿胶产品L-羟脯氨酸含量≥8.0%，甘氨酸含量≥18.0%，丙氨酸含量≥7.0%，L-脯氨酸含量≥10.0%。实验结果表明，41批药品阿胶及9批阿胶珠氨基酸含量均符合药典规定，合格率为100.0%；17批食品（保健食品）阿胶中有2批氨基酸含量测定值低于规定值（其中1批甘氨酸含量17.4%，L-脯氨酸含量9.8%；另外1批甘氨酸含量16.3%，L-脯氨酸含量8.9%），合格率为88.2%。

图3 氨基酸混合对照品溶液色谱峰

2.5 特征多肽含量测定结果

药材对照品驴源多肽对照品质谱检测结果见图4，样品驴源多肽含量测定结果见图5。结果表明，41批药品阿胶驴源多肽含量0.16%～0.25%，9批阿胶珠驴源多肽含量0.16%～0.23%，全部符合新版《药典》的规定；17批食品（保健品）阿胶含量在0.04%～0.22%，其中6批少于0.15%，不符合新版《药典》规定。

图4 驴源多肽对照品监测离子对LC-MS图

图5 样品中驴源多肽含量检测结果

2.6 探索性研究

2.6.1 杂皮源筛查

杂皮源筛查结果显示，41批药品阿胶及9批阿胶珠均呈现与阿胶对照药材保留时间一致的色谱峰；食品（保健食品）阿胶中有13批样品均呈现与阿胶对照药材保留时间一致的色谱峰，3批样品呈现与牛皮特征肽A保留时间一致的色谱峰，1批样品呈现与牛皮特征肽A和新阿胶对照药材保留时间一致的色谱峰；阿胶糕中有5批样品呈现与阿胶对照药材保留时间一致的色谱峰且无其他杂皮源特征峰，5批样品除了具有与阿胶对照药材保留时间一致的色谱峰外还有与其他杂皮源特征峰保留时间一致的色谱峰，9批样品未呈现与阿胶对照药材保留时间一致的色谱峰，5批呈现与马皮源特征峰保留时间一致的色谱峰，10批呈现与牛皮源特征峰保留时间一致的色谱峰，5批呈现与猪皮源特征峰保留时间一致的色谱峰，部分批次样品表现为多种特征峰掺杂。

2.6.2 铬（Cr）含量检测

《阿胶中铬（Cr）含量检查的补充检验方法》规定，阿胶中铬含量应≤2.0 mg/kg。实验结果显示，药品阿胶中铬含量为0.077～0.442 mg/kg；食品（保健食品）阿胶中铬含量为0.103～1.230 mg/kg；阿胶糕中铬的含量为0.000～2.230 mg/kg，其中有1批超出限度要求。

3 结论

通过本次风险监测专项检验发现，新的质量标准项目设置合理，能有效控制产品质量，新增特征多肽的含量测定能杜绝杂皮源的掺入；药品阿胶及阿胶珠总体质量状况较好，未发现掺伪造假情况；食品（保健食品）阿胶特别是阿胶糕总体质量状况较差，存在以杂皮、劣质皮投料生产的情况。建议生产企业积极参加技术培训，加强原药材的采购、使用管理，严把质量关；监管部门加强对生产企业的监督检查，针对杂皮投料问题，对生产企业进行现场检查，从源头控制产品的质量。