胰岛素样生长因子-1预处理对原代心肌细胞缺氧损伤的保护作用

吴连连，胡安康

（徐州医科大学 实验动物中心，江苏徐州 221004）

IGF-1是一种促生长因子，参与调节脊椎动物的体细胞生长和多种代谢过程，在维持机体结构和功能方面具有重要作用[1-2]，如促进细胞增殖、分化，抑制炎症等[3-4]。IGF-1也是心脏结构和功能的重要调节因子，研究证明其能有效改善心肌梗死后心功能恢复。心肌梗死是威胁人们生命健康的最常见的心血管疾病之一，心肌细胞缺氧是导致心肌梗死的重要原因。本实验通过原代细胞培养，经过缺氧培养制备心肌细胞缺氧模型，观察缺氧后的一些损伤指标特征和凋亡情况，探讨IGF-1对缺氧造成的心肌细胞损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级新生1～3 d的KM小鼠，雌雄不限，用于原代心肌细胞培养。由徐州医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(苏)2020-0011]。

1.2 试剂与仪器

IGF-1（HY-P7070），美国 MedChemExpress公司；MTT试剂盒（C0009S），上海碧云天生物技术有限公司；DMEM/F12培养基（PWL107），大连美仑生物技术有限公司；胎牛血清（085-150），维森特生物技术（南京）有限公司；胰酶（C0201），上海碧云天生物技术有限公司；II型胶原酶（QN0512），美国Gibco公司；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（A020-1-2）、肌酸激酶（CK）检测试剂盒（A032-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（A001-3-2）以及丙二醛（MDA）检测试剂盒（A003-1-2），南京建成生物工程研究所；兔抗alpha-Actin单克隆抗体（ab124964），英国Abcam公司；山羊抗兔红色荧光二抗（ab150080），英国Abcam公司。

BX53荧光显微镜，日本奥林巴斯公司；IX73光学显微镜，日本奥林巴斯公司；Synergy2酶标仪，美国BioTek公司。

1.3 心肌细胞原代培养

预先配好0.08%胰蛋白酶、0.05%Ⅱ型胶原酶和0.04%胰蛋白酶等量配比的混合溶液。在无菌条件下快速取出乳鼠心脏，用D-Hanks液冲洗，在培养皿中将心脏剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的小碎块。以0.08%胰蛋白酶消化5～8 min，静置后弃去上清液，再用0.05%Ⅱ型胶原酶和0.04%胰蛋白酶混合液37 ℃消化10 min，吸取消化后的上清加入离心管中，再以同样方法消化一次，两次上清合并，向上清液中加入约1/3（体积）的DMEM/F12培养基以终止消化作用。过200目网筛，1 200 r/min转速离心12 min。弃上清。用50 mL DMEM/F12培养基重悬细胞，移入培养瓶中进行差速贴壁，90 min后取细胞悬液以1 000 r/min离心10 min，所得沉淀用培养基轻轻吹散以纯化心肌细胞。最后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液调整细胞至适当浓度，接种于培养皿，48 h后更换培养液。

1.4 药物预处理及缺氧模型建立

造模前24 h将状态良好的细胞更换成无血清培养基。实验分为3组，正常组即不做任何处理的细胞，缺氧组即模型组，细胞经过缺氧处理，IGF-1预处理组在造模前1 h加入终浓度为200 ng/mL的IGF-1。正常组细胞在普通培养箱中正常培养，缺氧组和IGF-1干预组细胞转至缺氧培养箱（37 ℃，94% N2，l%O2，5% CO2）中孵育24 h进行缺氧处理建立缺氧模型，随后进行各项检测。

1.5 α-Actin染色鉴定心肌细胞纯度

吸去培养基，将贴壁的心肌细胞用0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次。4%的多聚甲醛固定细胞（4 ℃，20 min）吸干液体后用0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次并吸去PBS。用10%正常羊血清（含0.3%TritonX-100）室温封闭 1 h，然后吸干，加入α-Actin（1∶500）抗体并于4 ℃过夜。第二天将细胞先拿出复温0.5 h，吸干抗体，0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次后吸干，加入TRITC标记的荧光二抗(1∶1 000)避光孵育1 h后PBS洗3次，并用DAPI核染液染细胞核5 min，后经PBS洗3次，于荧光显微镜下观察荧光。

1.6 MTT法检测细胞活力

MTT溶液的配制：用5 mL MTT溶剂溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL的MTT溶液。配制后即刻使用，或分装后-20 ℃避光保存。

通常细胞增殖实验每孔加入100 μL 2 000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100 μL 5 000个细胞（具体每孔所用的细胞数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等决定）。按照实验需要，进行培养并给予0～10 μL特定的药物刺激。每孔加入10 μL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解。在37 ℃下孵育4 h，然后在570 nm测定吸光度，按式（1）计算存活率。

细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD） （1）

1.7 LDH、CK、SOD活性和MDA含量的测定

按照之前分组，细胞经缺氧后，收集各组细胞和上清，处理好样品，按照各检测试剂盒说明书操作，通过比色法测定各物质含量、活性。

1.8 统计学分析

利用图像分析软件和Photoshop 5.0软件（Adobe）对图像进行处理，所有资料用SPSS 16.0统计软件处理，以平均数±标准差（±s）表示，组间均数的比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组比较用t检验，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 α-Actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度

原代心肌细胞培养2 d的明场图见图1（a），心肌细胞纯度常用α-Actin染色鉴定，见图1（b），可见α-Actin染色呈阳性，纯度大于95%。从图中可以看见明显的心肌特异性横纹结构，并且在镜下可见心肌细胞成片同步搏动，表明心肌细胞状态良好。

图1 原代心肌细胞形态学及α-Actin染色鉴定

2.2 IGF-1对心肌细胞活力的影响

运用MTT法测定各组心肌细胞活力，结果见表1。与正常组相比，缺氧组细胞存活率显著降低（P＜0.05），说明缺氧使心肌细胞存活率下降，对细胞活力造成影响；与缺氧组相比，IGF-1干预显著提高了细胞存活率（P＜0.05），细胞活力明显增强。IGF-1可以改善缺氧造成的细胞存活率降低，对细胞损伤有显著抑制作用，这也体现了IGF-1的促生长调节的功能。

表1 各组心肌细胞存活率

2.3 IGF-1对LDH、CK、SOD活性以及MDA含量的影响

心肌细胞缺氧损伤后LDH、CK活性显著升高（P＜0.05），说明缺氧造成心肌细胞明显损伤，SOD活性下降（P＜0.05），MDA含量显著上升（P＜0.05）。而IGF-1处理则缓解了这种损伤，明显降低了LDH、CK活性（P＜0.05），使SOD活性显著升高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）。具体数据见表2。LDH、CK、SOD活性和MDA含量可以评价细胞应激损伤的程度。缺氧会造成细胞氧化系统的失衡，自由基堆积，引起细胞损伤。而IGF-1对这种应激损伤具有一定抑制作用，可以减少心肌细胞氧自由基生成，有利于心肌损伤后的恢复。

表2 各组LDH、CK和SOD活性及MDA含量

3 结论

近年来，IGF-1在心血管疾病中的作用被重视。有研究发现，IGF-1可以促进细胞生长和抵抗细胞死亡，与心肌细胞的发育和生长密切相关，显示出对心血管疾病的保护作用[5]。另有研究报道，IGF-1在损伤心肌细胞中表达异常升高，提示IGF-1在心肌损伤中的重要性[6]。

CK和LDH是临床上评价心肌损伤的重要标志物[7]。当细胞损伤时，细胞膜破坏，胞内的CK和LDH会释放至细胞外使血液中含量显著上升而被检测到。SOD和MDA是与氧化应激相关的两个常用指标。SOD活性与其清除自由基的能力相关，当SOD活性下降时，清除自由基的能力就减弱，会导致大量自由基堆积[8]。而自由基堆积会进一步使细胞膜的脂质过氧化，MDA则反映了这种过氧化程度，还可间接反映受自由基攻击的严重程度[9]。心肌细胞缺氧后会发生一定损伤，细胞活力下降，CK和LDH活性明显上升，而细胞清除自由基能力下降，即SOD活性下降，自由基堆积造成MDA含量显著升高。已有研究表明，急性心肌梗死后，IGF-1可以改善其不利的微环境，进而促进心肌修复[10-11]。本实验中，笔者观察到IGF-1预处理缓解了心肌细胞缺氧后的损伤变化，与缺氧组相比，IGF-1能够显著降低CK、LDH活性和MDA含量，提高SOD活性，提升细胞活力。

本次研究表明IGF-1是一个可以有效缓解心肌损伤的生长因子。其主要通过抗氧化增强清除自由基能力，增加损伤心肌细胞活力，从而发挥心肌细胞缺氧损伤后的保护作用。