远志-石菖蒲药对不同配比对PC12细胞凋亡的影响

邸学，王一博，刘雅晴，王海波，王雯睿

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁大连 116600）

石菖蒲是常用的醒脑开窍药，具有化湿开胃、开窍豁痰、醒神益智的功效，《本经》称它“开心孔，补五脏，通九窍，明耳目”，《别录》谓之“聪耳目，益心智”。远志亦有安神益智、祛痰开窍的功效，《本经》谓其“利九窍，益智慧，耳目聪明，不忘，强志倍力”［1］。因远志与石菖蒲都具有开窍宁神益智的作用，常配对应用于老年痴呆疾病的治疗，并被作为组方用药的基本结构。

老年痴呆（Alzheimer Disease，AD）在中医学属于“呆病”“郁证”“文痴”“善忘”等范畴，中医认为其病位在脑，与心肝脾肺肾功能失调关系密切。临床多从益智、化痰、祛瘀、调心、补肾以及开窍等多角度治疗，尤其安神益智、化痰开窍法历来颇受重视，而“远志-石菖蒲”就是体现这一治法的经典药对，在开心散、定志丸、定志小丸、远志散等治疗“好忘”的经典方剂中广泛使用[2-4]。

研究发现，应用远志-石菖蒲配伍的用量有10.0∶3.0、8.0∶3.0、7.0∶3.0、2.0∶1.0、7.0∶5.0、4.0∶3.0、1.0∶1.0、1.0∶2.5和1.0∶4.0等不同比例[5-6]。国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录（第一批）》收录《备急千金要方》之开心散，组成根据宋校本所载处方确定，但与《新雕孙真人千金方》中所记载的剂量差异较大[7]。张林等[8]通过两个版本及相关医籍的文献研究，对该方的剂量进行了分析考证，认为开心散方剂中远志-石菖蒲药量比例应为1∶1。

文献对远志、石菖蒲药对或单味药及其有效成分的药理作用研究较多，但有关此药对间最佳配伍比例及其活性物质作用于AD细胞模型的作用机制还有待进一步探讨。本实验通过远志-石菖蒲合用对谷氨酸致神经细胞凋亡的保护或营养功能研究，从细胞水平探讨远志-石菖蒲配伍比例和药效作用，为远志和石菖蒲药对的开发利用提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

远志、石菖蒲药材（批号C161170、C150785），大连权健医药公司；PC12细胞，中国医学科学院基础医学研究所；DMEM培养基（批号8121277），Gibco公司；L-谷氨酸、Heochst 33342（批号20180519、20210408），Solarbio公司；青链霉素、胰蛋白酶消化液（批号C0222、C0207），Beyotime公司；胎牛血清（批号20110703），浙江天杭生物科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）、氧化丙啶（PI）（批号L1905092、A1720090、H1902001），阿拉丁公司；无水乙醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

HP-40 CO2培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净台，苏州安泰空气技术有限公司；SJIA-5FE冷冻干燥机，宁波市双嘉仪器有限公司；ST-360酶标仪，KHB科华生物；80-2离心机，湖南湘仪实验室仪器开发公司；Mini Shaker摇床，Kylin-Bell Lab Instruments；Ti-S倒置荧光显微镜，日本尼康公司；A60倒置荧光显微镜，德国Leica公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液制备

（1）远志-石菖蒲药对不同配比样品液（见表1）。分别取远志、石菖蒲药材粉碎，过2号筛。远志、石菖蒲、远志-石菖蒲不同配比（1∶1、1∶4）按料液比1∶10（g∶mL）分别加入60%乙醇或蒸馏水，浸泡后加热回流提取2 h，过滤，得到远志水提液与醇提液、石菖蒲水提液与醇提液、远志水提液-石菖蒲醇提液（1∶1）、远志-石菖蒲（1∶1）醇提液和远志-石菖蒲（1∶4）醇提液，分别浓缩至约5 g/mL，水提液、醇提液先后置于-20 ℃、-80 ℃冷冻4 h，制成冻干粉备用。

表1 溶液制备方法

取各组冻干样品，分别加入PBS缓冲液溶解，配制成1.0 mg/mL、3.0 mg/mL、5.0 mg/mL和7.5 mg/mL的远志水提（醇提）干粉溶液和石菖蒲水提（醇提）干 粉 溶 液，3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和10.0 mg/mL的远志水-石菖蒲醇（1∶1）干粉溶液，5.0 mg/mL的远志-石菖蒲（1∶1）醇提干粉溶液，3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和 10.0 mg/mL的远志-石菖蒲（1∶4）醇提干粉溶液。经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

（2）含谷氨酸培养液配制：取谷氨酸适量，加PBS缓冲液溶解，配制成100 mmol/L的溶液，再加10%胎牛血清的DMEM培养液稀释至10 mmol/L，经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3.2 细胞培养

PC12细胞置于37 ℃、5% CO2、95%空气饱和湿度的培养箱中，在10%胎牛血清的DMEM培养液培养。取对数生长期的PC12细胞，加入0.25%胰酶液消化，加入DMEM培养液终止消化，转入离心管中，3 000 r/min离心2 min。弃去上清液，加入培养液反复吹打后，将细胞均匀接种于96孔板（2×104cell/孔），继续培养。

1.3.3 分组给药

细胞培养12 h后弃去原培养液，分别加入90 μL正常培养液或含谷氨酸培养液，再分别加入10 μL PBS缓冲液或不同配比样品液，每组设3或6个复孔，继续培养24 h。

1.3.4 细胞活性检测

取培养的细胞板，避光加入MTT溶液（5 μg/mL）10 μL，继续培养4 h，弃去上清液。每孔加入DMSO 100μL，振摇3 min，酶标仪测定492 nm处吸光度值（A）。

细胞活力比=(A给药组-A模型空白组)/(A正常对照组-A模型空白组)×100%

1.3.5 Hoechst 33342/PI染色

分组给药后的各组细胞分别加入10μL含500 μg/mL PI的PBS溶液，使其终浓度为50 μg/mL，继续培养20 min，弃去上清液。PBS溶液冲洗两次，再加入30 μL Hoechst 33342染色液覆盖住细胞，室温避光放置5 min后轻缓吸除染色液，PBS溶液冲洗两次。荧光显微镜下观察分析。

2 结果与分析

2.1 远志-石菖蒲不同配比样品保护作用研究

取远志-石菖蒲不同配比样品组及不同浓度组进行细胞活性检测，以正常细胞组（细胞活力值100%）和谷氨酸损伤模型组（细胞活力值0%）为参照，根据各组吸光度值（n=6）计算细胞活力比，结果见图1。

图1 各组样品溶液保护作用结果图

结果表明，石菖蒲水提干粉（AW-7.5）在试验浓度范围内无抗谷氨酸致细胞损伤作用，石菖蒲醇提取物在浓度7.5 mg/mL（AE-7.5）时抗谷氨酸致细胞损伤的作用效果最好；远志水提取物浓度和醇提取物在浓度5 mg/mL（PW-5.0和PE-5.0）时，抗谷氨酸致细胞损伤的作用效果最好；远志水-石菖蒲醇（1∶1）提取浓度5 mg/mL（PWAE1∶1-5.0）和远志-石菖蒲醇提取物浓度7.5 mg/mL（PEAE1∶4-7.5）时，抗谷氨酸致细胞损伤的作用效果最好。

对比分析5 mg/mL浓度的不同组别样品抗谷氨酸致细胞损伤的作用效果，发现远志醇提取物（PE-5.0）、水提取物（PW-5.0）的作用效果略强于石菖蒲的醇提取物（AE-5.0），远强于石菖蒲的水提取物（AW）；远志水-石菖蒲醇提取物的作用效果（PWAE1∶1-5.0）略强于远志-石菖蒲醇提取物（PEAE1∶1-5.0）；远志-石菖蒲醇提取物（PEAE1∶4-5.0）抗谷氨酸致细胞损伤的作用最强。

远志醇提取物7.5 mg/mL给药组（PE-7.5）细胞活力值远小于远志醇提取物5 mg/mL（PE-5.0）和远志水提取物7.5 mg/mL给药组（PW-7.5）的细胞活力值，其原因可能是醇溶液中远志皂苷类成分提取率高、成分含量高，在超过一定浓度后该类成分的细胞毒性导致PC-12细胞损伤、活力下降甚至凋亡。石菖蒲的醇提取给药组细胞活力远强于石菖蒲的水提取物组，提示醇提取方式可能更适合石菖蒲中相关的药效活性成分的提取富集。

细胞外谷氨酸浓度增加可激活谷氨酸受体，造成神经元持续兴奋，介导细胞Ca2+内流超载，产生大量自由基，形成氧化应激，产生兴奋性神经毒性损伤神经细胞。资料表明，远志水提物可提高机体内抗氧化能力，清除过多的自由基，抑制或减轻细胞过氧化损伤；石菖蒲也具有抗缺氧、清除自由基的作用[3]。远志-石菖蒲药对能显著提高AD模型大鼠脑组织中SOD活力，降低MDA和NO含量，减少氧自由基的产生，加速清除过氧化脂质，减轻氧自由基对脑组织的损伤[9]。结合本研究结果，远志、石菖蒲抗谷氨酸致细胞损伤作用可能与其所含成分的抗氧化作用有关。远志皂苷、糖脂等成分（水溶性较强），石菖蒲中细辛醚、丁香酚等活性成分（醇溶性较强）可能通过清除过量自由基、减轻谷氨酸兴奋性神经毒性损伤作用维持细胞活力。

2.2 远志-石菖蒲抑制细胞凋亡作用研究

不同样品组细胞经Hoechst 33342染色液/PI双染后，在倒置荧光显微镜下观察，不同提取方法样品典型结果如表2所示。

表2 各组细胞凋亡、坏死染色分析结果

结果表明，远志-石菖蒲合用抑制细胞凋亡作用效果优于远志、石菖蒲单独使用；远志水-石菖蒲醇提取物5 mg/mL（PWAE1∶1-5.0）和远志-石菖蒲醇提取7.5 mg/mL（PEAE1∶4-7.5）抑制细胞凋亡的效果较好。

远志水-石菖蒲醇（PWAE1∶1）与远志-石菖蒲醇（PEAE1∶1）提取物组均能够明显抑制细胞凋亡，但远志-石菖蒲醇提取物5 mg/mL浓度组（PEAE1∶1-5.0）早期凋亡细胞数多于同浓度的远志水-石菖蒲醇实验组（PWAE1∶1-5.0），可能是因为醇溶液中远志皂苷类成分细胞毒性作用因含量增高而增强所致。这也提示在进行开心散、定志丸等含远志药材的经典名方剂开发应用时，需注意方剂的加工生产工艺参数优化，既要保证其药效作用，又要避免其副作用[10-12]。

3 结论

远志-石菖蒲合用抗谷氨酸致细胞损伤的作用效果优于远志或石菖蒲单独使用，说明远志与石菖蒲配对应用于老年痴呆疾病的治疗、作为组方常用对药是具有科学内涵和药效物质基础的。远志-石菖蒲配伍中石菖蒲所占比例高的实验组能明显抑制细胞凋亡，提示远志与石菖蒲用药比例应在开心散方剂1∶1比例基础上，根据药物活性成分的提取效率、血药浓度和组织分布情况进行适当调整，以达到减低远志细胞毒副作用、增强药物合用整体作用效果的目的。