银耳子实体油脂成分分析及其抗氧化活性研究

刘美，刘嵬，梁立，甘亚，郑瑞凤，何钢,2*

（1.成都大学 药食同源植物资源开发高校重点实验室/四川抗菌素工业研究所/药学院，四川成都 610106；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000）

银耳（TremellafuciformisBerk）是担子菌纲银耳科银耳属药食同源真菌，又名银耳子、雪耳、白木耳，素有“菌中之冠”之称，是药食同源真菌中珍品，自然分布于四川、福建、云南等地，其中四川以“通江银耳”最为著名[1-2]。银耳的功效成分主要包括银耳多糖、肽类化合物、氨基酸、不饱和脂肪酸和微量元素。中医药理论认为银耳具有开胃补脾、益气和血、滋阴润肺等作用[1,3]。现代临床医学研究表明银耳具有降血脂[4]、降血糖[5]、抗辐射[6]、抗氧化[7]、免疫调节和抗肿瘤[8]等多种药理作用。

目前，在市售银耳的品质鉴别方面尚缺乏快速、有效、科学的手段，主要以银耳多糖的含量和生理活性的大小来评价品质，检测灵敏度和便捷性较差。脂类是除蛋白质、核酸、糖类外的具有重要生理活性的生物大分子，是银耳子实体的重要组成成分。真菌子实体的脂类化合物的提取方法主要包括机械压榨法、溶剂抽提法[9]、索氏抽提法[10]、CO2超临界萃取法[11]、超声波萃取、膜辅助萃取、固相微萃取、反胶团溶液萃取、电泳萃取[12]等多种方法。脂类化合物的化学分析方法主要采用气相色谱（GC）或气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，GC-MS技术在定性和定量分析中具有灵敏、准确、快捷的特点，广泛应用在油脂和挥发精油的定性和定量检测。但银耳子实体油脂作为银耳品质评价指标，以及油脂组成类别、相对含量差异与其品质是否具有联系还未见报道。

本实验以通江银耳为材料，采用索氏油脂提取法制备不同批次的通江银耳子实体油脂，柱前衍生化后用GC-MS定性分析油脂的化学成分，比较3批银耳子实体油脂成分的差异；并测定银耳子实体油脂体外清除DPPH自由基的活性，以考察其抗氧化能力。研究结果为通江银耳子实体的品质鉴定，以及银耳油脂保健产品的开发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

通江银耳，购买于通江裕德源生态农业科技有限公司，其商品名和产地相符，包装完好且在保质期内。

SQ8气相色谱质谱联用仪，美国PerkinEimer公司；Elite-5弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美国PerkinEimer公司；UV-2600紫外可见分光光度计，日本Shimadzu公司；JY-1000A型高速多功能粉碎机，上海塞耐机械有限公司；HWS-12型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；N-1001型旋转蒸发器，上海爱朗仪器有限公司；YP-202电子天平，上海天美天平仪器有限公司；UPT-Ⅱ-10T超纯水机，四川优普超纯科技有限公司。

氢氧化钠、石油醚、正己烷、甲醇、无水乙醇，分析纯，成都市科隆化学品有限公司。

1.2 银耳子实体油脂制备

银耳子实体60 ℃干燥，粉碎后过40目筛备用。称取银耳子实体粉15.0 g，按照料液比1∶20（g∶mL）加入石油醚，80 ℃索氏回流提取8 h，60 ℃蒸馏回收石油醚溶剂，得到银耳脂溶性提取物[13]。

1.3 银耳子实体油脂的甲酯化衍生

按照文献[14-18]的方法，移取银耳子实体脂溶性提取物50 μL于100 mL具塞三口瓶中，加入10 mL正己烷溶解。待油脂充分溶解后再加入10 mL 0.4 mol/L的NaOH溶液（甲醇溶解），置于磁力搅拌器混合均匀，室温下静置反应30 min。加入10 mL去离子水猝灭反应，于磁力搅拌器混匀后室温下静置2 h，待完全分层后取上层有机相，对甲酯化衍生产物进行GC-MS分析。

1.4 银耳子实体油脂甲酯化衍生产物的GC-MS分析

GC-MS条件参照文献[19]方法。

GC条件：柱压11.9 kPa；高纯度氦气（99.999%）为载气，流速1.45 mL/min；进样量1 μL，分流比为19∶1；柱温升温程序：初始温度为100 ℃，以10 ℃/min的速率升至200 ℃，再以2 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速率升温至260 ℃，保持4 min；气化室温度为250 ℃。

MS条件：倍增器电压为0.92 kV；接口温度250 ℃；离子源为电子轰击离子源（EI），离子源温度200 ℃；碰撞能量为70 eV；溶剂延迟4.5 min；扫描范围为m/z45～ 400。

1.5 DPPH清除能力测定

准确称取500 mg银耳子实体油脂，以乙醇为溶剂溶解并定容于50 mL容量瓶中，配制成10 mg/mL的银耳子实体油脂母液，采用对半稀释法配制成0.625 mg/mL、1.250 mg/mL、2.500 mg/mL、5.000 mg/mL、10.000 mg/mL的系列浓度样品。

银耳子实体油脂对DPPH的清除能力按照文献[20-21]的方法进行评价。取上述不同浓度的银耳子实体油脂乙醇溶液0.5 mL与1.5 mL现配的DPPH乙醇溶液混合均匀，在黑暗中37 ℃反应30 min，于517 nm处测定上清液的吸光度。空白对照组为1.5 mL DPPH溶液与0.5 mL无水乙醇充分混合，相同浓度的Vc为阳性对照。按照公式（1）计算自由基清除率。

式中，A0为空白对照管的吸光度，As为样品组或阳性对照组的吸光度。

2 结果与分析

2.1 银耳子实体油脂成分鉴定

通过GC-MS对甲酯化衍生的脂溶性成分进行了测定，得到如图1所示的总离子流图谱。从3批通江银耳油脂成分中分离检测到16个组分，结合NIST质谱数据库匹配结果和相关文献报道对离子碎片进行分析，采用面积归一化法计算得到12个化合物的相对百分含量，3个批次油脂样品的组分分析结果如表1所示。

图1 银耳子实体油脂成分总离子流图

表1 银耳子实体油脂成分组成

3个批次的银耳子实体油脂总百分含量占比分别达到了55.19%、51.99%、53.17%。第1、3批次的通江银耳中的脂溶性成分含量要略高于第2批次，但并无显著差异，品质均良好。如表1所示，通江银耳子实体油脂的主要成分为油酸、棕榈酸、硬脂酸，各批次中3个主要成分的含量分别占油脂总含量的92.92%、93.40%和93.08%。通过共有成分的分析，饱和脂肪酸棕榈酸和不饱和脂肪酸油酸可用于通江银耳的鉴别和银耳油脂含量的定量分析参考指标。

2.2 银耳子实体油脂DPPH清除能力

评价了3个批次的银耳子实体油脂对DPPH自由基的清除能力，结果如图2所示。不同批次的银耳子实体油脂对DPPH的清除能力无明显差异，在0.625～10.000 mg/mL范围内，对DPPH自由基的清除能力呈现出一定的剂量依赖性。当银耳子实体油脂浓度达到10.000 mg/mL时，3个批次的油脂对DPPH自由基的清除率分别为19.75%、18.12%、19.23%，EC50值依次为 24.07 mg/mL、25.19 mg/mL、24.59 mg/mL。但银耳子实体油脂的DPPH清除能力显著低于Vc阳性对照组。

图2 银耳子实体油脂清除DPPH自由基作用

3 结论

本实验使用NaOH甲醇溶液进行柱前衍生化反应，将银耳子实体油脂衍生为挥发性的甲酯化产物，经气相色谱-质谱联用检测，初步分离鉴定了通江银耳的12个脂溶性组分，发现不同批次的银耳子实体所含的油脂成分及相对百分含量无显著差异，其中油酸、棕榈酸、硬脂酸为主要的油脂成分。DPPH自由基清除实验结果表明，通江银耳子实体油脂对DPPH具有一定的清除能力，其清除效果呈现明显的剂量依赖性，清除能力均显著低于Vc。本实验结果将为通江银耳品质鉴定指标的选择提供理论基础，为进一步探讨银耳子实体脂溶性成分的抗氧化等生物活性提供参考。