仿生栽培铁皮石斛内生真菌QZQM08培养条件优化研究

徐焰平

（泉州医学高等专科学校，福建泉州 362000）

随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性的问题日益突出，寻找新的抗菌物质是当前相关领域学者的主要任务之一，而从具有抑菌作用的内生真菌代谢产物中筛选是其中一个重要途径[1-2]。课题组前期从仿生栽培铁皮石斛中分离到一株具有抑菌功能的内生真菌QZQM08，其代谢产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌均有抑制作用[3]。为了更好研究代谢产物抑菌效果，通过开展内生真菌QZQM08培养条件优化研究，找到适合该菌生长的最适培养成分和培养条件，以期为筛选抑菌活性物质提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

内生真菌QZQM08：分离自福建泉州仿生栽培铁皮石斛，接种于PDA斜面培养基，低温（4 ℃）保存于泉州医学高等专科学校健康学院医学检验实训室。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基：称取200 g马铃薯，洗净去皮切片，加水1 L煮沸15 min，纱布过滤后再加20 g葡萄糖，加水补足至1 L[4]。

马铃薯蔗糖培养基：将马铃薯葡萄糖培养基中的葡萄糖替换为20 g蔗糖，其他参数不变。

马丁氏培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、3‰孟加拉红100 mL，定容至1 L。

察氏培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，定容至1 L[5]。

沙氏培养基：葡萄糖40 g，蛋白胨20 g，定容至1 L[6]。

1.1.3 仪器设备

BSC-1500ⅡA-X生物安全柜，济南鑫贝西生物技术有限公司；Eclipse E200数码显微镜，日本Nikon公司；DNP-9162电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；HVE-50高压灭菌锅，日本Hirayama公司；KYC-100B恒温培养摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱，上海合恒仪器设备有限公司；TDZ4-WS台式低速自动平衡离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.1.4 试剂

葡萄糖、蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、麦芽糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉、脲、硝酸钾和硝酸铵，分析纯，广州市西陇化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉，生化试剂（BR），广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试验方法

采用PDA培养基，将内生真菌QZQM08放置于培养箱28 ℃活化培养5 d，用灭菌的双蒸水冲洗真菌菌落表面孢子，配制成浓度为0.5×106～1.0×106个/mL的孢子溶液以备后续实验使用[7]。

1.2.1 不同液体培养基对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

在250 mL锥形瓶中分别装入50 mL马铃薯葡萄糖培养基、马铃薯蔗糖培养基、马丁氏培养基、察氏培养基和沙氏培养基，分别接种1 mL孢子溶液。将锥形瓶放置于28 ℃、200 r/min恒温培养摇床培养6 d[8]。培养结束后，将发酵培养物转入离心管，8 000 r/min离心10 min，倒掉上层培养液后60 ℃烘干至恒重，称量菌丝干重。每种培养基设置5个重复。

1.2.2 不同培养温度对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

以马铃薯葡萄糖培养基为基础培养基，将内生真菌QZQM08分别置于20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃和45 ℃培养，其他条件同1.2.1，每个温度设置5 个重复[9]。

1.2.3 不同pH对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

以马铃薯葡萄糖培养基为基础培养基，将内生真菌QZQM08分别接种于pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0的培养基，放置于恒温培养摇床培养，其他条件同1.2.1，每个pH设置5个重复[10]。

1.2.4 不同接种量对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

以马铃薯葡萄糖培养基为基础培养基，分别接种内生真菌QZQM08孢子液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，每个接种量设置5个重复，其他培养条件同1.2.1[11]。

1.2.5 不同碳源对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

以马铃薯葡萄糖培养基为基础培养基，分别以20 g/L葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖和可溶性淀粉作为碳源，每一种碳源设置5个重复，其他培养条件同1.2.1[12-13]。

1.2.6 不同氮源对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

以马铃薯葡萄糖培养基为基础培养基，分别加10 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、脲、硝酸钾和硝酸铵作为氮源，每一种氮源设置5个重复，其他培养条件同1.2.1[14-15]。

1.2.7 正交试验

在单因素试验的基础上，在影响较大的接种量、pH、碳源（葡萄糖）和氮源（酵母浸粉）4个因素中筛选出比较适合内生真菌QZQM08菌丝生长的3个水平，进行4因素3水平的正交试验（见表1），其他培养条件同1.2.1[16]。

表1 正交试验因素水平设计

1.2.8 数据统计

使用IBM SPSS Statistics 26进行Duncan's多重比较分析，结果以均值±标准差的格式表示，P＜0.05表示数据具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

内生真菌QZQM08在所选的5种培养基上均能生长，但是生长速度有明显的不同。从表2中还可以发现，不同液体培养基上内生真菌QZQM08的菌丝产量不同，按照菌丝产量排序为马铃薯葡萄糖培养基＞沙氏培养基＞马丁氏培养基＞马铃薯蔗糖培养基＞察氏培养基，说明内生真菌QZQM08最适合在马铃薯葡萄糖培养基中生长。

表2 液体培养基类型对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

2.2 不同培养温度对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

如表3所示，内生真菌QZQM08在20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃均能生长，在45 ℃菌丝几乎不生长；在28 ℃条件下内生真菌QZQM08菌丝产量最大，说明内生真菌QZQM08最适合在28 ℃进行培养。

表3 培养温度对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

2.3 不同pH对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

如表4所示，内生真菌QZQM08在所选pH供试培养基中均能生长，在pH为5.0、5.5和6.0的培养基中生长较好，培养基pH=5.5时菌丝产量最大，说明pH=5.5最适合内生真菌QZQM08菌丝的生长。

表4 pH对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

2.4 不同接种量对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

如表5所示，接种量对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响不显著，当接种量为0.5 mL时已基本满足培养要求，当接种量为1.0 mL时菌丝产量最大，说明较适合菌丝的生长，因此本研究其他单因素实验的接种量均为1.0 mL。

表5 不同接种量对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

2.5 不同碳源对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

如表6所示，内生真菌QZQM08在添加所选碳源的培养基中均能生长，但是菌丝产量有明显的差异，碳源为葡萄糖的培养基中菌丝产量最大，说明葡萄糖最适合内生真菌QZQM08菌丝生长。

表6 碳源类型对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

2.6 不同氮源对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

如表7所示，内生真菌QZQM08在添加所选氮源的培养基中均能生长，但是菌丝产量有明显的差异，氮源为酵母浸粉的培养基中菌丝产量最大，说明酵母浸粉最适合内生真菌QZQM08菌丝生长。

表7 氮源类型对内生真菌QZQM08菌丝产量的影响

2.7 正交试验结果

根据单因素试验结果，当培养温度为28℃内生真菌QZQM08菌丝产量最大，以接种量、pH、碳源和氮源4个因素中筛选出比较适合内生真菌QZQM08菌丝生长的3个水平，进行4因素3水平的正交试验，见表8。试验得出组合2培养出的菌丝产量最大，得出菌株最佳培养条件：培养基成分碳源为20 g/L葡萄糖、氮源为10 g/L酵母浸粉，接种量为1 mL，pH为6.0。

表8 正交试验方案及其结果

3 结论

试验结果表明，仿生栽培铁皮石斛内生真菌QZQM08在液体马铃薯培养基中生长良好。菌丝的产量与接种量、培养基成分和培养条件有关，最佳液体培养基为在马铃薯基础培养基中添加20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母浸粉，接种量为1 mL，pH为6.0，培养温度为28 ℃。