不同碳源对小球藻生长的影响

杜梦帆，王露

（长治学院 生命科学系，山西长治 046011）

小球藻是一种集众多优点和经济价值于一身，极具开发应用潜力的生物质能源，被广泛应用于环保、农业、医药、美容、食品和水产养殖等行业[1]。为充分发挥小球藻的应用价值，最重要的是要提高其生产能力。微藻生长情况受到多种环境因素的影响，如温度、光强、盐度、pH和培养基成分等[2]。

培养基中的碳源能为微生物体内有机物质的合成提供碳骨架，也为其生命活动提供必需的能量。不同的碳源参与微生物体内碳代谢的途径也不尽相同，对于促进微生物生长和油脂储存的程度也有所差别[3]。谢林静等[4]对比了葡萄糖和乙酸钠作为碳源时C.protothecoides型小球藻的生物量，结果表明无论是单一培养或是混合培养，小球藻对葡萄糖的利用率都优于乙酸钠。梁长利等[5]对比了以葡萄糖、乙酸钠和蔗糖作为唯一有机碳源时异养小球藻的生物累积量，结果排序为蔗糖＞葡萄糖＞乙酸钠，并且高浓度葡萄糖和乙酸钠会抑制其生长。

已有研究表明适中的温度、光照强度以及碱性环境有助于小球藻迅速繁殖[6-8]，但最适碳源的种类与浓度，因藻种和品质的不同而存在明显差异。为探究某高品质淡水小球藻的最适碳源种类，通过光密度OD680值、血球计数板和叶绿素含量综合分析其在不同碳源条件下的生长规律，为后续研究和小球藻的大规模培养提供一些有效的基础实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用小球藻（Chlorella）由上海光语生物科技有限公司提供。

硝酸钠、EDTA-Na2、蔗糖，天津奥普升化工有限公司；磷酸氢二钾、硫酸镁、无水碳酸钠、丙酮，天津市风船化学试剂科技有限公司；硼酸、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉，天津市凯通化学试剂有限公司；柠檬酸、柠檬酸铁胺，新乡市化学试剂厂；钼酸钠、硫酸铜，天津市化学试剂四厂；无水氯化钙，天津市天达净化材料精细化工厂；硫酸锌，天津市耀华化学试剂有限责任公司；氯化锰，北京市朝阳区化工四厂；氯化钴，沈阳市试剂二厂；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LRH-250A型生化培养箱，广东泰宏君科学仪器股份有限公司；FA224型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHZ-D（III）型循环水式真空泵，上海秋佐科学仪器有限公司；BC/BD-1028T型海尔冰箱，青岛海尔集团；Centrifuge 5424R型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；TU-181OS型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；B204LED型生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；SX-500型快速自动高压灭菌锅，日本TOMY公司。

1.3 小球藻扩培

本实验采用BG-11培养基扩大培养小球藻，培养基配方参考文献[1]。取藻液和培养基按照体积比1∶4进行接种，在光照强度为3 000 lx，温度为25 ℃和光暗比为12 h∶12 h的环境下培养5～7 d，待藻液颜色明显加深后进行下一次扩培，直至藻液数量满足后续实验需求。

1.4 实验设计

本实验以不添加任何碳源的培养基作为空白样。在保证培养基整体碳元素质量不变的前提下，将BG-11培养基配方中的柠檬酸和碳酸钠分别替换为葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉和蔗糖。取对数生长期的小球藻藻液60 mL分别与60 mL灭菌的不同碳源培养液接种至250 mL的锥形瓶中，在1.3项条件下连续培养7 d。

1.5 测定方法

本实验以BG-11培养液做空白对照，用分光光度计测其在680 nm下的光密度值（OD680），连续监测7 d后以天数为横坐标，光密度值为纵坐标绘制小球藻的生长曲线。同时，培养7 d后用血球板计数法观察小球藻的数量浓度，并以文献[9]中的标准方法提取叶绿素，配合分光光度计测定藻液中叶绿素的浓度。每个处理组设置3个平行样，最终结果取其平均值。

2 结果与分析

2.1 光密度值结果分析

不同碳源培养基的小球藻连续培养7 d后得到如图1所示的生长曲线。可以看出空白组的小球藻在培养周期内的光密度值趋于稳定，与其他外加碳源的处理组相比长势较弱，但也未出现衰亡的情况，表明小球藻可以利用大气中的无机碳满足其生长需要，但利用率低于各种外加有机碳源。此外，以葡萄糖为碳源的处理组中小球藻长势最好，在培养周期内小球藻生物量大致呈稳步上升趋势，蔗糖处理组次之。麦芽糖和淀粉处理组，从第3 d开始小球藻OD680基本相同，生物量缓慢增加随后进入生长稳定期。

图1 不同碳源培养基的小球藻的生长曲线

2.2 血球板计数和叶绿素浓度结果分析

培养7 d后，对不同碳源培养基的小球藻进行血球板计数和叶绿素提取测定的结果见图2。空白样的小球藻细胞密度和叶绿素累积量都是最小的，进一步证实小球藻在有机碳源培养下的生物量产率更高，而部分无机碳进入细胞后生成的CO32-可能会与基础培养基中的Ca2+反应生成沉淀，使碳源无法得到有效利用[8]。不同有机碳源处理组小球藻的增殖情况和叶绿素累积量差异较大。就血球计数板结果而言，不同碳源对小球藻生长的促进效果排序为单糖＞淀粉＞二糖，且二糖中麦芽糖高于蔗糖，这与张维国[10]的研究结果是一致的。葡萄糖是最简单的糖类，可以直接被生物所吸收利用，是培养小球藻最理想的碳源。但对于叶绿素含量来说，葡萄糖作为碳源时，其叶绿素含量仅位于中等水平，这是因为小球藻利用葡萄糖的过程中会产生有机酸和CO2，使得培养体系的pH下降，而pH发生变化不利于叶绿素累积[5,11]。当采用麦芽糖作为唯一有机碳源时，叶绿素累积量最高，可能是因为其pH变化幅度较小。

图2 不同碳源处理组的血球板计数与叶绿素含量

3 结论

为探究某高品质淡水小球藻的最适碳源，本文通过光密度OD680、血球计数板和叶绿素含量3个参数分析其在不同碳源条件下的生长规律。结果发现，空白组的小球藻生长最为缓慢却未出现衰亡，表明小球藻可以利用大气中的CO2作为碳源，但利用率较低；葡萄糖作为唯一碳源时，不利于叶绿素累积，但小球藻生物累积量和细胞密度均优于其他各处理组，因此综合判断可认为葡萄糖是培养该品质小球藻最适宜的碳源。