气相色谱法测定人血白蛋白辛酸钠含量的方法优化

王文杰，吴翠，宋大章，吴浩蔚

（广东卫伦生物制药有限公司，广东汕头 515071）

人血白蛋白在临床上主要用于失血创伤、烧伤引起的休克以及脑水肿和损伤引起的颅压升高等的治疗。人血白蛋白制品中加入适量的辛酸钠，可以保证制品的稳定性，但是辛酸钠有很多生物学作用，如引起低血糖症，对各类动物有麻醉作用，增加氧的消耗，降低肝脏对长链脂肪酸的清除作用，血管舒张作用以及降低肌肉收缩力等作用[1]。《中华人民共和国药典》三部（2020年版）[2]中规定，人血白蛋白辛酸钠含量为“每1 g蛋白质中应为0.140～0.180 mmol”。笔者长期使用该方法发现，该方法重复性不理想，容易出现实验室偏差。经分析，出现偏差的原因可能是4 mL三氯甲烷挥干后，再加100 μL三氯甲烷溶解残渣不完全，进样溶液浓度不能代表供试品溶液浓度，因此笔者拟删去药典中辛酸钠含量测定方法中的“将三氯甲烷挥发至干，另加三氯甲烷100μL溶解残渣”，即不挥发至干直接进样，开展人血白蛋白辛酸钠含量测定（气相色谱法），对优化前、后的方法进行对比研究，进一步提升检验的效率和水平。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

GC-2010Plus气相色谱仪（配FID检测器），日本岛津公司；BP21色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 um），澳大利亚SGE公司；CPA225D电子微量天平，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 药品与试剂

辛酸标准品（批号6827100），纯度99.5%，美国CHEM-SERVICE公司；庚酸标准品（批号6415900），纯度99.5%，美国CHEM-SERVICE公司；高氯酸（批号20150701），色谱纯，天津政成化学制品有限公司；三氯甲烷（批号20160106-2），分析纯，广州化学试剂厂；人血白蛋白供试品（10 g/瓶，批号20180712、20180813、20180814、20180815、20180916、20181017），广东卫伦生物制药有限公司；人血白蛋白质控品（批号20170421-3），广东卫伦生物制药有限公司；每1 g蛋白质中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸钠的加标回收率溶液，广东卫伦生物制药有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件与系统适用性试验

用酸改性聚乙二醇毛细管柱（20 m），柱温160 ℃，火焰离子化检测器，检测器温度230 ℃，气化室温度230 ℃，载气(氮气)流速为35 mL/min。

辛酸峰与庚酸峰的分离度应大于1.5，辛酸峰的拖尾因子应为0.95～1.20，辛酸对照品溶液连续进样5次，所得辛酸峰与庚酸峰面积之比的相对标准偏差应不大于5%。

1.3.2 内标溶液的制备

取庚酸，加三氯甲烷制成每l mL三氯甲烷中含10 mg庚酸的溶液，即得。

1.3.3 测定方法

取供试品，用水准确稀释成蛋白质含量为40～50 g/L的溶液，即为供试品溶液。精密量取供试品溶液0.5 mL，加内标溶液30 μL与1.5 mol/L高氯酸溶液0.2 mL，于振荡器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，加盖，于振荡器上剧烈混合2 min，以3 000 r/min离心20 min，除去上层水相，小心将三氯甲烷层倾入10 mL试管中，取0.1 μL注入气相色谱仪。

另精密称取辛酸对照品0.15 g，置于10 mL容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，即为辛酸对照品溶液。精密量取辛酸对照品溶液10 μL、20 μL、30 μL、40 μL 和 50 μL，分别精密加内标溶液 30 μL，于振荡器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，同法操作。以各辛酸对照品溶液峰面积与内标溶液峰面积比对各辛酸对照品溶液辛酸量（μg）作直线回归，求得直线回归方程，并计算出供试品溶液辛酸绝对量及供试品辛酸钠含量。

1.3.4 重复性试验

取人血白蛋白质控品（批号20170421-3）作为供试品，重复测定6次，根据标准曲线计算辛酸钠含量。

1.3.5 加标回收率试验

取每1 g蛋白质中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸钠的加标回收率溶液作为供试品，每个浓度分别制备3份进行测定，根据标准曲线计算辛酸钠含量。

2 结果与分析

2.1 系统适用性图谱峰面积的变化

由表1可知，不挥干，直接进样法（优化后的方法）所得峰面积较小，这是因为优化后方法的辛酸对照品溶液不挥发至干，直接进样使得浓度变低，峰面积变小，但不影响积分。连续5针辛酸峰与庚酸峰面积之比的RSD值由药典方法的0.1%变为3.0%，但仍符合系统适用性要求（不大于5%）。实验时间由2 d缩短为1 d。

表1 系统适用性结果

2.2 重复性试验比较

由表2可知，方法优化前、后的重复性试验RSD值分别为4%、2%。对两组数据进行方差齐性检验，F=1.108，P=0.317＞0.05，方差具有齐性，即两组数据精密度无显著性差异，表明进样浓度降低并不影响实验结果的精密度。

表2 重复性试验结果（n=6）

2.3 加标回收率试验比较

由表3可知，药典方法测得的9次回收率的平均值为97.7%，RSD值为1.70%；不挥干，直接进样法测得的9次回收率的平均值为99.7%，RSD值为1.55%。对两组数据进行单因素方法分析，F=7.530，P=0.02＜0.05,两组数据有显著性差异。方法优化后准确度更接近100%，这是因为优化后的方法不受挥干速度的影响[3]，进样溶液比药典方法均匀，损失量相对较小。

表3 回收率试验结果

2.4 样品含量测定

应用优化后的人血白蛋白辛酸钠含量测定方法，对广东卫伦生物制药有限公司生产的6批人血白蛋白（10 g/瓶）进行辛酸钠含量测定，结果见表4。各批次人血白蛋白中辛酸钠含量均符合《中华人民共和国药典》规定，辛酸钠含量的平均值为0.161 mmol/g蛋白，RSD值为2%，与理论投料量0.160 mmol/g蛋白较接近。

表4 样品含量测定结果（n=6）

3 结论

本研究优化后的方法不需要将三氯甲烷挥干后再加100 μL三氯甲烷溶解残渣，缩短了试验时间，减少了挥发的三氯甲烷对人和环境的影响[4-5]。结果证明，优化后的方法重复性好，准确度较高，适用于人血白蛋白辛酸钠含量测定。