小檗碱抑制JAK2/STAT3信号通路缓解高糖诱导的足细胞EMT和凋亡

吴 昊，杨 琳，唐丽琴,2，魏 伟

作者单位：1安徽医科大学临床药理研究所，抗炎免疫药物教育部重点实验室，合肥 2300322中国科学技术大学附属第一医院药剂科，合肥 230001

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是一种慢性肾病，是1型和2型糖尿病的一种慢性微血管并发症。高血糖、高血脂、代谢异常、微血管循环障碍和炎症反应等都可以引起糖尿病肾病的发生。糖尿病肾病的主要病理特征是肾小球基底膜增厚、细胞外基质增生、系膜细胞增殖、足细胞损伤和肾小管纤维化等[1]。研究[2]发现，足细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和凋亡在糖尿病肾病足细胞损伤中起着重要作用，足细胞发生EMT和凋亡后会使肾小球的滤过屏障受损，肾小球滤过率降低，出现蛋白尿，加快糖尿病肾病进程。信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是酪氨酸激酶2(janus kinase 2，JAK2)的下游信号[3]，JAK2的激活可引起STAT3的磷酸化，磷酸化的STAT3会影响细胞的生长、凋亡和EMT过程[4]。小檗碱(berberine，BBR)是一种季铵类生物碱，具有降血糖、调节血脂、抑制炎症和肾脏保护等作用，课题组前期研究[5-6]发现，BBR可能在DN的发生发展中起着重要作用，但是其具体机制仍不清晰。因此该文研究了BBR对足细胞EMT和凋亡的缓解作用以及其与JAK2/STAT3信号通路的关系，为临床上对DN的防治提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器小鼠MPC5细胞系(BNCC 337685)，BBR(BW 50137，纯度为98.37%，高效液相色谱法)购自北京北纳创联生物技术研究院。细胞凋亡试剂盒(货号：AP101-100-kit，杭州联科生物技术股份有限公司)；抗荧光淬灭剂(货号：P0126，上海碧云天公司)；RPMI 1640培养基(货号 ：SH30809.01，上海江林生物科技有限公司)；Transwell 小室(货号：3422，Corning公司)；兔抗磷酸化酪氨酸激酶2(phosphorylated janus kinase 2，p-JAK2)抗体(货号：4406T)、鼠抗STAT3抗体(货号：9139S)、兔抗磷酸化信号转导子和转录激活子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)抗体(货号：9145S)、兔抗细胞凋亡调节因子(bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim)抗体(货号：2933)购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗JAK2抗体(货号：17670-I-AP)、鼠抗波形蛋白(vimentin)抗体(货号：60330-1-Ig)购自武汉Proteintech公司；兔抗足细胞裂孔膜蛋白(nephrin)抗体(货号：ab216341)、鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(货号：ab7817)购自英国abcam公司。激光共聚焦显微镜购自德国莱卡公司；OLYMPUS CKX 31型倒置显微镜购自日本奥林巴斯有限公司；FC贝克500型贝尔曼流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；电泳架购自北京六一仪器厂；Image Quant Las 4000 mini型化学发光成像分析仪购自美国GEHealthcare Life Sciences公司；电子分析天平购自上海精天电子仪器厂。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将复苏的足细胞用含有10%血清、1%双抗、0.2% γ-干扰素的 RPMI 1640完全培养基重悬，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞长至培养瓶的90%左右时，消化离心进行后续实验。

1.2.2流式细胞术检测细胞凋亡 6孔板中加入2 ml 1×106/ml细胞悬液，细胞贴壁后随机分为5组，即正常组(Control，葡萄糖浓度11.1 mmol/L)、模型组(HG，葡萄糖浓度30 mmol/L)和不同浓度BBR给药组(30、60、90 μmol/L)，按分组加高糖刺激和给药之后继续培养24 h，用不含EDTA的胰酶消化，1 500 r/min，4 ℃离心10 min后，去除上清液，每管加入500 μl稀释5倍的Binding buffer，混匀，将混匀后的液体转移至流式管中，加入凋亡试剂盒中的相应抗体，室温避光孵育5 min后，上机检测观察每组细胞的凋亡情况。

1.2.3划痕实验检测细胞迁移 在6孔板背面水平划出三条平行的直线，间距相等，然后将细胞悬液接种于6孔板中，待细胞长至6孔板的80%左右时在孔中均匀的划出与背面直线垂直的三条直线，PBS清洗2次，分组加刺激和给药同1.2.2项，于0、24 h在显微镜下拍照留存，用image J软件分析划痕面积，并按公式计算划痕愈合率，划痕愈合率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100 %。

1.2.4Transwell法检测细胞迁移 24孔板中加入500 μl含15% FBS的RPMI 1640培养基，然后将Transwell小室放入24孔板中，上室加入200 μl 1×104/ml含5% FBS的RPMI 1640培养基的细胞悬液，分组和加药同1.2.2项，培养24 h后取出 Transwell小室，预冷PBS洗2次，洗去死细胞，用含0.05%结晶紫的PBS染色20 min，PBS清洗2次，擦去上室未迁移的细胞，倒置显微镜下观察结果，随机选取5个视野拍摄保存，计算每个视野的细胞数。

1.2.5Western blot检测相关蛋白表达 将细胞悬液以1×108个/孔接种于6孔板，分组及加药同1.2.2项，37 ℃培养24 h后，PBS清洗2次去除死细胞，每孔加100 μl RIPA细胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制剂=99 ∶1 ∶1)，放置1 h后，将细胞刮下并收集于EP管，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，吸上清液于新的EP管中，加入适量5×蛋白上样缓冲溶液，煮沸10 min后得到蛋白。进行10% SDS-PAGE电泳，分别孵育nephrin、α-SMA、vimentin、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bim蛋白对应抗体，最后于化学发光成像分析仪上进行检测，所得结果用image J软件进行灰度分析。

1.2.6激光共聚焦法检测nephrin、α-SMA、vimenin的表达 将细胞悬液接种于含有盖玻片的24孔板中，分组加刺激和给药同1.2.2项，37 ℃培养24 h后，预冷PBS洗去死细胞，经过4%多聚甲醛100 μl固定30 min、0.5% BSA 120 μl封闭1 h、一抗80 μl 4 ℃孵育过夜、荧光二抗(1 ∶100)120 μl 37 ℃孵育2 h、DAPI 100 μl染核10 min等步骤后，指甲油封片。激光共聚焦显微镜下观察细胞荧光结果并拍照留存。

2 结果

2.1 BBR对足细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示(图 1)，HG组与Control组相比，足细胞凋亡率上升(F=38.627，P<0.01)；BBR给药组(30、60、90 μmol/L)与HG组相比，足细胞凋亡率逐渐降低。

2.2 BBR对足细胞迁移能力的影响划痕实验结果显示(图2A)，HG组与Control 组相比，划痕愈合率增加(F=34.139，P<0.01)；BBR给药组(30、60、90 μmol/L)与HG组相比，划痕愈合率逐渐降低，BBR给药组(30、60、90 μmol/L)均能降低足细胞的异常迁移。Transwell实验结果显示(图2B)，HG组与Control组相比，迁移到下室的足细胞增多(F=51.417，P<0.01)；BBR给药组(30、60、90 μmol/L)与HG组相比，迁移到下室的足细胞减少。

2.3 BBR对p-JAK2、p-STAT3和Bim蛋白表达的影响Western blot结果显示(图 3)，HG组与Control组相比，足细胞的p-STAT3、Bim和p-JAK2的蛋白表达增加(F=10.875、30.433、13.709，P<0.05)；BBR给药组(30、60、90 μmol/L)与HG组相比，足细胞的p-STAT3、Bim和p-JAK2的蛋白表达降低。

图1 BBR对足细胞凋亡的影响

图2 BBR对足细胞迁移能力的影响

图3 BBR对p-JAK2、p-STAT3和Bim蛋白表达的影响

2.4 BBR对nephrin、α-SMA 和vimentin表达水平的影响Western blot结果显示(图4A)，HG组与Control组相比，足细胞上nephrin的蛋白表达降低(F=9.382，P<0.05)，vimentin和α-SMA的蛋白表达增加(F=6.628、3.683，P<0.05)；BBR给药组(30、60、90 μmol/L)与HG组相比，能够增加足细胞上nephrin的蛋白表达，降低vimentin和α-SMA的蛋白表达。激光共聚焦结果显示(图4B)，HG组与Control组相比，足细胞核和细胞质上的nephrin的荧光强度降低(F=9.722，P<0.01)，足细胞质上vimentin和α-SMA的荧光强度增加(F=12.931、4.820，P<0.05)，即nephrin的表达降低，vimentin和α-SMA的表达增加；BBR 给药组(30、60、90 μmol/L)与HG组相比，能够增加nephrin的荧光强度，降低vimentin和α-SMA的荧光强度，即nephrin的表达增加，vimentin和α-SMA的表达降低。

3 讨论

足细胞是一种终末分化的上皮细胞，覆盖在肾小球基底膜外，是肾小球滤过屏障的重要组成部分，对维持肾小球滤过功能至关重要[7]。DN时，足细胞的形态和数量发生变化，即足细胞肥大，足突融合甚至消失，足细胞丢失等[8]。足细胞丢失是DN足细胞损伤的显著性标志，有研究[9]发现，足细胞EMT和凋亡是造成足细胞丢失的主要机制，它们在足细胞损伤中起着关键作用。足细胞EMT是指足细胞失去其标志性的上皮特征而获得间充质细胞特征的过程。足细胞发生EMT后，其上皮细胞样标志蛋白如nephrin、E-cadenrin和ZO-1等表达降低，间充质细胞样标志蛋白如α-SMA、vimentin等表达升高，迁移能力增加，可使足细胞从肾小球基底膜上脱落，使肾小球滤过屏障受损，出现蛋白尿[10-11]。足细胞凋亡是足细胞的一种程序化死亡，发生凋亡后，其凋亡能力升高，数量显著减少，可使肾小球的滤过屏障受损，肾小球的滤过率降低，进而出现一系列肾脏疾病。本实验研究结果显示，使用30 mmol/L葡萄糖成功刺激足细胞24 h 后，足细胞出现EMT和凋亡现象。与Control组相比，HG组足细胞的迁移能力增加，足细胞上nephrin表达降低，α-SMA、vimentin和Bim表达增加。而不同浓度BBR 给药后，足细胞的凋亡率降低，异常迁移减少，足细胞上nephrin表达增加，α-SMA、vimentin和Bim表达降低。这些结果说明BBR可以缓解高糖诱导的足细胞EMT和凋亡，发挥保护足细胞作用。但具体作用机制不明，仍需进一步探索。

JAK2/STAT3信号通路是重要的信号转导通路，在生物体中广泛存在，参与多种疾病的发展过程。JAK2是STAT3的上游激酶，活化后的JAK2会激活 STAT3，使STAT3在Y705位点上被磷酸化[12]。磷酸化的STAT3会以二聚体的形式从细胞质进入细胞核，激活细胞因子应答基因的转录[13]。研究[14]表明，JAK2/STAT3信号通路在细胞的EMT和凋亡中发挥着重要作用，如：JAK2/STAT3通路可诱导转录因子Slug的上调，促进胶质瘤细胞EMT过程；姜黄素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活来缓解脓毒症肾损伤细胞的异常凋亡[15]。本实验通过检测JAK2/STAT3信号通路的相关蛋白显示，HG刺激足细胞后，p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达增加，足细胞发生EMT和凋亡现象。BBR 给药后，p-JAK2、p-STAT3的表达降低，足细胞的EMT和凋亡现象随之减轻。由此可以得出，高糖可能通过调节JAK2/STAT3信号通路导致足细胞EMT和凋亡，而BBR可能通过调节JAK2/STAT3信号通路来缓解这种现象的发生。

图4 BBR对nephrin、α-SMA和vimentin表达的影响

综上所述，HG刺激能够激活JAK2/STAT3信号通路，诱导足细胞的EMT和凋亡过程，而BBR可以通过抑制JAK2/STAT3信号通路来缓解足细胞的EMT和凋亡过程，调节相关蛋白的表达，发挥对足细胞保护作用。