Inflammasomes/caspases通路与细胞焦亡、细胞凋亡在动脉粥样硬化中的不同作用❋

谷依檬，汤紫薇，吴艳艳，薛 梅

(中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

《中国心血管病报告2018》数据显示，心血管病死亡率占城乡居民死亡构成比首位。随着当代生活经济负担加重、饮食糖分和热量的增加以及人口老龄化的加速，今后数十年的心脑血管疾病患病率仍处于一个较为快速的增长期[1，2]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)致冠状动脉狭窄可引起心绞痛发作，斑块破裂血栓形成闭阻血管易导致心肌梗死。如何有效抑制AS斑块形成和稳定斑块以减少心血管事件的发生，对防治心血管病具有非常重要的现实意义。1856年Rudolph Virchow发现，AS斑块中存在巨噬细胞，提出炎症在AS过程中起重要作用，此后脂质浸润学说、氧化学说、损伤应答学说陆续被提出[3]。1993年，Ross教授[4]在其损伤反应学说基础上提出AS是一种炎症性疾病，而不是单纯的由于脂质沉积所致。越来越多的证据表明，免疫炎症反应(细胞凋亡、细胞焦亡)是贯穿于AS发展始终的关键病理生理机制，免疫炎症学说成为AS防治的新突破口[3-6]。

1 基于半胱天冬酶(caspases)通路的细胞凋亡

凋亡也称程序性死亡，在机体新陈代谢、发育、进化中起着不可替代的重要作用[7]。细胞凋亡具有独特的生物化学和形态学特征，先出现细胞皱缩、胞浆致密、核染色质凝集，而后胞核裂解、DNA片段化，形成含核碎片和(或)细胞质成分的细胞内含物，最后被临近巨噬细胞识别吞噬[8，9]。

1.1 细胞凋亡途径

目前公认的细胞凋亡途径包括细胞凋亡膜受体通路、内质网应激凋亡通路和线粒体凋亡通路[10，11]。

1.1.1 细胞凋亡膜受体通路 在细胞凋亡膜受体通路中，作为肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，Fas跨膜蛋白在外界的相关因素刺激下与其对应的FasL受体相结合，该过程促使Fas跨膜蛋白三聚化，三聚化的Fas跨膜蛋白和相应配体FasL结合后吸引细胞质中带有相同死亡结构域的蛋白FADD(fas associated with death domain)[12]，FADD跨膜蛋白上的DD结构域(death domain)和Fas跨膜蛋白的DD结构域相结合，随后该蛋白的DED(death effector domain)再与另一个含有DED的后续成分相连接，由此引发DED与无活性的同型半胱氨酸酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase 8的分子，caspase 8分子随即从无活性的单链酶原转变为有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，细胞发生凋亡[13-15]。

1.1.2 线粒体凋亡通路 线粒体凋亡途径由线粒体介导，线粒体是细胞进行有氧呼吸、释放能量的主要场所。在心肌细胞缺血、缺氧、慢性炎症等因素刺激下，B细胞淋巴瘤-2基因家族促凋亡蛋白(bcl2-associated x protein，Bax)寡聚化，促使细胞色素C从线粒体释放入细胞质，细胞色素C与细胞质中的凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor1,Apaf1)、pro Caspase 9、ATP/d ATP相结合[16]，形成大分子蛋白复合物，该复合物也被称为凋亡体[17]。在凋亡体形成之后，casepase 9被激活，激活的casepase 9与Apaf1，ATP/d ATP依次激活下游凋亡信号通路相关的caspase，如caspase3，从而诱导细胞凋亡[18]。

1.1.3 内质网应激通路 在冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CHD)所诱导的内质网应激凋亡通路中，缺血缺氧等促凋亡因素可通过CHOP/GADD153途径、c-Jun氨基末端激酶途径、Caspase 12蛋白酶途径3条信号通路活化凋亡信号分子[19]，并同时加速内质网钙离子的外流，增加细胞质内钙离子浓度来激活钙离子依赖性蛋白酶，钙离子浓度的增加还可作用于线粒体，使其通透性增加，释放细胞色素C，并与其Apaf1相结合，进一步激活Caspase 3和Caspase 7，上述作用机制共同加速细胞的凋亡[10,20，21]。

1.2 细胞凋亡与AS

在线粒体凋亡通路中，B淋巴细胞瘤-2基因家族分为促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bcl-XS、Bad等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等)[21，22]，AS中氧化型低密度脂蛋白(human oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可降低Bcl-2/Bax的比例，从而诱发细胞凋亡[23]，在细胞凋亡膜受体通路，被巨噬细胞摄入的ox-LDL通过激活巨噬细胞表面Fasl的表达[9,24]，从而发生Fasl介导的细胞凋亡。细胞凋亡内质网应激通路是近年来新发现的凋亡通路，目前尚未有文献对内质网应激凋亡通路与AS进行合并讨论。但有研究发现，在巨噬细胞参与AS凋亡的过程中存在跨膜钙梯差的变化，促进凋亡通路的启动。而内质网应激通路中，内质网钙离子外流合并伴有细胞质内钙离子浓度增加[10,21，22]。由此可见，二者均与细胞内钙离子的浓度变化相关联，间接说明内质网应激通路可能参与AS的凋亡过程，并通过改变细胞内外钙离子浓度促进AS凋亡。

2 基于inflammsomes/caspases通路的细胞焦亡

细胞焦亡(pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在与炎症相关的疾病中发挥着重要作用。

2.1 细胞焦亡途径

在细胞焦亡通路中，固有免疫扮演着重要角色。固有免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，也称为非特异性免疫。固有免疫系统中的模式识别受体监控细胞所处微环境的各种变化以及危险信号，目前所发现的模式识别受体家族有Toll样受体、黑素瘤缺乏2样受体[(absence in melanoma 2)-like receptor,ALR]、C型凝集素受体、RIG-Ⅰ样受体(RIGⅠ-like receptor,RLR)、富含亮氨酸重复序列受体和三联基序蛋白(tripatite motif,TRIM)，其中富含亮氨酸重复序列受体(NOD-like receptor,NLR)，ALR，RLR和TRIM受体参与多种蛋白构成的炎症小体[25，26]。在模式识别受体中，因NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)的相关研究最多，且NLRP3的激活配体涉及范围较为广泛，并与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系较为密切，故本文将以NLRP3为切入点探索其炎症反应通路[27-29]。目前所认可的NLRP3激活途径有2条信号通路，其一为通过病原体相关分子模式或者损伤相关分子模式途径激活核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路，调节DNA转录，促进NLRP3、白细胞介素18前体(pro interleukin 18,pro-IL-18)、pro-IL-1β的分泌；其二为NLRP3炎症小体的组装与活化[30，31]。炎症小体由3部分组成，即细胞质传感器(NLR、ALR、RLR)、半胱天冬酶1前体和凋亡相关斑点样蛋白[32]。当细胞质传感器NLRP3受到ATP、病毒RNA或其他异物等刺激，NLRP3会被收集到线粒体相关的内质网中，同时高尔基体收集蛋白激酶，蛋白激酶会磷酸化无活性的细胞质传感器NLRP3，使其暴露出寡聚化结构域，并与凋亡相关斑点样蛋白、Caspase 1共同组成NLRP3炎症小体。Caspase 1促进pro-IL-18、pro-IL-1β转化为IL-18、IL-1β，同时Caspase 1被未知的剪切作用剪切成Gasdermin D，从而介导细胞的焦亡[33，34]。

2.2 细胞焦亡与AS

目前在焦亡通路中发现的经典inflammasomes主要包括NLR、ALR、RLR和TRIM[35]。其中NLRP3、NLRP1、AIM2被证实在AS发生发展过程中发挥了重要作用[36-38]。当AIM2过度表达时，ApoE-/-小鼠的AS斑块病变区域明显增大，AIM2通过caspase 1途径介导Gasdermin D的活化[39]；Rajamaki等[40]研究表明，在AS斑块中，过量的极低密度脂蛋白胆固醇可激活NLRP3炎症小体，促使IL-1β、IL-18表达上调，从而介导巨噬细胞的凋亡，加速动脉粥样硬化斑块的形成。Shi等[41]发现，在患者的动脉粥样硬化斑块中，凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD,ASC)、caspase 1、NLRP3、IL-1β、IL-18的表达均显著上调。在上述研究中，caspase 1介导的细胞焦亡与动脉粥样硬化斑块的形成和发展过程关系较为密切，NLRP3、caspase 1、IL-18、IL-1β等细胞焦亡相关分子表达水平对动脉粥样硬化疾病的转归及预后可能产生重要影响[34]。

3 细胞焦亡与细胞凋亡的相互串扰和转化

细胞焦亡与细胞凋亡之间存在串扰和转化[14,42]：caspase 3/6/7作为效应caspases参与细胞凋亡，而caspase 1则作为炎症小体经典通路的下游关键效应蛋白，诱导细胞焦亡，共同促进AS的发生发展。caspases及其介导的蛋白剪切和活化过程是多种细胞程序性死亡(凋亡、焦亡)的串扰和相互转化的直接证据[43，44]。据Melanie Fritsch等[14]最新研究表明，作为凋亡通路的启动子，caspase 8可抑制由受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)及混合系激酶区域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导的细胞程序性坏死，caspase 8不仅参与细胞凋亡通路，同时也是细胞焦亡通路的组成部分，caspase 8的激活促使ASC形成、焦亡关键蛋白caspase 1活化以及IL-1β表达，由此可见caspase 8是连接细胞凋亡及焦亡的关键桥梁，参与调控细胞凋亡与细胞焦亡的串扰和转化。

细胞凋亡和细胞焦亡在细胞形态学和关键通路蛋白的表达上均有差异。首先，形态学上两者均发生DNA裂解，但细胞焦亡状态下细胞发生肿胀、溶解、细胞核完整性丧失[9]，而细胞凋亡状态下的细胞体积缩小，细胞核固缩，细胞核仍具有完整性[9,45]。其次，从效应蛋白的表达来看，Caspase 3、Caspase 9为细胞凋亡所特有的效应蛋白，Caspase 1、Caspase 4、Caspase 5、Caspase 11为细胞焦亡所特有的效应蛋白[45-47],Caspase 8为细胞凋亡、焦亡所共有的效应蛋白[14](见表1)。

表1 细胞凋亡与细胞焦亡的区别

4 基于inflammasomes/caspases通路干预AS的药物研究进展

2017年《新英格兰医学杂志》发表的CANTOS研究，首次为抗炎治疗减少不良心血管事件提供了高级别的循证医学证据[48]，免疫炎症学说为AS的防治提供了新的角度[49]。据Y Lin等[50]的相关研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)治疗可以通过调节血管内皮细胞(endothelial cell,ECs)、血管平滑肌细胞(vessel smooth muscle cells,VSMCs)和免疫细胞的功能，促进受损组织修复，并抑制免疫炎症反应，从而促使斑块消退。Saha S等[51]通过研究发现,天然化合物lupeol可诱导人类M1巨噬细胞的表型和功能改变，并对抗由氧化应激介导的胆固醇氧化主要产物7-酮-胆固醇所触发的促兴奋信号。其数据显示，lupeol在人M1巨噬细胞中具有免疫调节活性，这表明它作为治疗动脉粥样硬化的辅助药物是有效的。尽管许多药物如canakinumab已经被开发出以抑制动脉粥样硬化中的特定炎症通路，但它们在临床实际应用中仍面临一些困难，其中包括成本高昂[52]。一个替代性策略是重新利用已有的、较为便宜的具有广泛上游抗炎特性的药物，如甲氨蝶呤和秋水仙碱，以保护动脉粥样硬化[51，52]。

中医理论认为，脂质沉积造成的冠状动脉管腔狭窄是冠心病稳定期的主要病理改变，与中医学“血瘀”“血脉不通”的认识有相似之处[53]。但冠心病急性事件发生过程中的斑块破裂、免疫炎症反应、氧化应激损伤和组织坏死等病理改变远非单一血瘀病因所能概括，其发生与毒邪的骤发性、酷烈性、腐蚀性等特点多有类似之处[54]。以陈可冀院士为首的科研团队在充分认识AS斑块现代病理生理机制的基础上，结合传统中医学对“瘀”“毒”的认识，创新性地提出 “瘀毒致变”引发急性心血管事件的假说。“瘀毒致变”病因病机学说的提出，进一步推动了活血解毒法防治动脉粥样硬化、治疗CHD再发心血管事件的临床实践。众多学者开展了活血解毒治法和方药防治AS的系列研究，清心解瘀方、解毒活血方、四妙勇安汤均被证实能够防治AS并稳定斑块[55-59]。巨噬细胞在冠状动脉粥样硬化斑块的形成、破裂以及免疫炎症反应中具有重要的地位。吴伟[55]等通过研究发现，解毒活血方可明显减少动脉粥样硬化易损斑块兔模型IL-1β mRNA、CD40 mRNA的表达水平并稳定斑块。许颖智等研究发现[56]，四妙勇安汤可通过抑制P38促丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinases，P38 MAPK)、NF-κB 炎症相关信号通路，降低AS易损斑块动物模型血清中IL-1、IL-8、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、NF-κB等炎性因子标志物的表达，稳定斑块。鞠建庆等[57]相关研究表明，清心解瘀方可通过抑制NLRP3炎症小体的活化以进一步调控巨噬细胞的焦亡通路，减少IL-1β、IL-18炎症因子的释放，从而达到抗炎、稳定斑块的效果。Sung等[58]研究表明，人参提取物人参皂苷Rg3可降低脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成及NLRP3炎症小体活化，抑制泡沫细胞的形成，从而增强AS斑块的稳定性。Li等[59]经实验证实，冬青提取物冬青素A可显著改善大鼠主动脉内皮依赖性血管舒张功能，减少内皮细胞ROS等炎性介质的生成，促进NO合成，抑制内皮细胞焦亡及NLRP3活化，具有稳定斑块的作用。

5 结语

细胞凋亡、细胞焦亡所介导的inflammasomes/caspases通路在动脉粥样硬化相关疾病中扮演着重要角色。细胞凋亡及焦亡能够及时清除受损血管内皮细胞，并为细胞组织的增殖修复提供适宜的空间和微环境，但过于激烈的细胞凋亡可促使正常组织细胞程序性死亡，过于激烈的细胞焦亡会释放大量促炎性因子，形成局部炎症风暴[60，61]，加重组织、细胞的损伤程度，不仅会影响到受损的组织细胞，也会影响到正常组织细胞，进而影响受损组织的修复及疾病的预后转归[26]。

目前通过抑制免疫炎症反应调控细胞凋亡、细胞焦亡治疗AS的药物大多数尚处于实验阶段，且由于凋亡及焦亡就其本质而言，其实是生物体内的一种自我保护调节机制。国内外虽有相关动物实验证明，通过体外给药等途径降低细胞凋亡、焦亡及炎症因子的表达水平，会显著缩小AS斑块的面积[60，61]，但上述研究仅局限于病变部位的AS斑块。人体是一个有机整体，抑制细胞凋亡、焦亡及其所介导的炎症反应虽然会减小粥样硬化斑块面积、稳定斑块，但同时也会影响机体自身正常的免疫功能。过度抑制细胞焦亡的表达会降低机体抵抗外来病原微生物以及自身新陈代谢的能力，过度抑制细胞凋亡则会促进细胞组织的增殖分裂，增加肿瘤相关疾病的患病风险[45]。如何从整体角度出发，平衡二者及所介导的炎症反应在AS相关疾病中的表达水平及在AS相关疾病的不同转归演变阶段中所占比重，将是能否从整体改善患者预后的关键点和难点所在[61，62]。

多数处于实验研究阶段的西药往往是从单一机制和靶点对细胞焦亡、凋亡、炎性因子水平进行调控，但正如上文所述，人体是一个有机整体，各项通路机制环环相扣，从单一机制或靶点进行解释或治疗势必会打破机体本身的平衡，从而导致其他更为严重的疾病相关终点事件，中医中药方剂虽然从理论层面和判别疾病的诊断标准上与西方医学均有显著不同，但从药物组成及其疾病作用靶点来看，其用药选择的灵活性与作用靶点的多样性较西药更具优势。上述优势虽然显而易见，但由于单味中成药所含成分较为复杂，且同一方剂中药物与药物之间相互作用的未知性，均为阐明中药方剂的具体作用机制及其标准化研究带来困难，可以说其优势也正是其所面临的难点。

上述相关研究虽逐年增加，但深度尚且不足，仍有许多关键问题尚待诠释，如细胞凋亡和细胞焦亡之间是否存在反馈调节机制，细胞炎症反应的不同阶段细胞凋亡、细胞焦亡所占比重，以及如何通过基因或药物治疗等方式实现对CHD中血管内皮细胞凋亡、焦亡的调控，降低NLRP3、IL-1β、IL-18等炎性因子和caspase 1、caspase 8、Bax-2等促凋亡因子的过度表达，使其表达水平控制在较为合理的范围，是目前基于免疫炎症通路学说治疗CHD所面临的机遇与挑战。