海参多肽酶解工艺的优化

肖彦春, 关秀杰, 郝长红, 郝生宏, 李 爽

（辽宁农业职业技术学院, 辽宁营口 115009）

海参属于棘皮动物门海参纲的无脊椎动物, 全球有11000多种, 可食用的有40多种[1]。海参在各类山珍海味中位尊“八珍”, 国内外学者对40多种海参化学成分的研究表明, 海参体内富含氨基酸、维生素和化学元素等人体所需的50多种营养成分[2]。近年来, 对海参的深入研究发现, 其含有许多具有重要生物学活性的物质, 如酸性黏多糖、多肽、皂苷等[3]。研究表明, 海参多肽具有良好的溶解性和稳定性, 易被消化吸收, 具有降血压、预防心脑血管疾病、抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等功效[3-4]。

红极参属富含50多种搭配均衡的天然营养成分, 18种氨基酸, 丰富的维生素和矿物质, 蛋白质含量达36.2%, 脂肪含量仅有0.06%左右, 属高蛋白、低脂肪、低糖、低胆固醇的健康食品, 是海参中的保健营养极品。以红极海参体壁为原料, 以多肽得率为指标, 筛选合适的蛋白酶, 并优化其酶解工艺, 为以其为原料开发多肽产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器试剂

1.1.1 材料

干制红极参, 大连御品堂水产品有限公司提供；木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶, 河南万邦实业有限公司提供。

1.1.2 仪器设备与试剂

组织捣碎机、H1850型高速离心机、FA2004型天平、7230G型可见分光光度计、HWZ-24型电热恒温水浴锅等。

结晶牛血清蛋白（BSA）、三氯乙酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、硫酸铜等, 均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解工艺

将海参放入烧杯中, 加入去离子水并没过海参, 隔4 h换1次水, 进行脱盐处理。采用硝酸银滴定法进行检验, 若浸泡液中无白色沉淀析出则表示脱盐完成。

将海参剁碎, 称取5 g, 按料液比加水, 搅拌均匀, 用合适的酸碱溶液调节酶的最适的pH值, 加入一定量的酶, 调节水浴至合适的温度, 酶解一定的时间, 将其煮沸后计时10 min, 取下冷却, 使酶失去活性, 得到海参多肽酶解液。

1.2.2 蛋白酶的选择

取3个不同的酶（木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶）酶解海参。分别做3个平行试验。通过比较3种酶解液中多肽得率, 从中筛选出最佳蛋白酶。

蛋白酶的选择见表1。

表1 蛋白酶的选择

1.2.3 酶解单因素试验设计

（1）酶解温度的选择。温度对酶活性有很大影响, 温度过高或过低都会降低酶的活性。在加酶量为1500 U/g, 料液比为1∶4, 酶解pH值为6.5时, 酶解时间3 h, 设置温度分别为50, 55, 60, 65, 70℃, 研究不同温度对酶解液多肽得率的影响。

（2）酶解pH值的选择。在加酶量为1500 U/g, 料液比为1∶4, 酶解时间为3 h, 酶解温度65℃的条件下用浓度为0.05 moL/L的NaOH溶液和1%HCl溶液调节pH值, 在酶解pH值分别为5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5时, 研究不同pH值对酶解液多肽得率的影响。

（3）酶解时间的选择。在加酶量为1500 U/g, 料液比1∶4, 酶解温度为65℃, 酶解pH值6.5的条件下, 设置酶解时间分别为2, 3, 4, 5, 6 h, 研究不同酶解时间对酶解液多肽得率的影响。

（4）加酶量的选择。在料液比1∶4, 酶解温度为65℃, 酶解时间为4 h, pH值6.5的条件下设定加酶量为500, 1500, 3000, 4500, 6000 U/g, 研究不同加酶量对酶解液多肽得率的影响。

（5）料液比的选择。在加酶量为4500 U/g, 酶解pH值为6.5, 酶解温度为65℃, 酶解时间为4 h的条件下, 设置料液比分别为1∶3, 1∶4, 1∶5, 1∶5, 1∶6, 1∶7, 研究不同料液比对酶解液多肽得率的影响。

1.2.4 确定酶解最佳工艺条件的正交试验

基于单因素试验结果, 以多肽得率为考查指标, 采用三因素三水平L9（34）正交试验设计。研究木瓜蛋白酶酶解温度（A）, pH值（B）, 料液比（C）对指标的影响, 以确定最佳酶解反应条件。

L9（34）正交试验因素与水平设计见表2。

表2 L9（34）正交试验因素与水平设计

1.2.5 标准溶液曲线的测定

取6个50 mL容量瓶, 配置0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL的标准牛血清蛋白质溶液, 用水补至50 mL, 然后取6支试管, 试管分别加6 mL标准溶液在加入4 mL双缩脲试剂。以转速2000 r/min离心10 min, 在室温（20～25℃）下放置30 min, 于波长540 nm处进行比色。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。以蛋白质含量为横坐标, 吸光度作为纵坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程为Y=0.0717X-0.0024, 相关系数R2=0.9941。

1.2.6 多肽含量的测定

取5 mL酶解液至于离心管中, 加入100 mg/mL三氯乙酸溶液5 mL, 以转速4000 r/min离心15 min, 其上清液用50 mg/mL的三氯乙酸定容至50 mL的容量瓶中, 取6 mL再加4 mL双缩脲溶液到离心管中, 静置10 min, 以转速2000 r/min离心10 min, 取出用可见分光光度计进行比色测定。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的选择

不同蛋白酶的水解效果见表3。

表3 不同蛋白酶的水解效果

以酶解后多肽得率为指标, 从表3可以看出, 酶解能力由强到弱的排列顺序为木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞菠萝蛋白酶。因此选择木瓜蛋白酶作为海参多肽的最适佳分解酶。

2.2 酶解工艺的优化

2.2.1 酶解温度对多肽得率的影响

酶的催化作用受温度影响很大, 温度升高, 反应速率加快, 但随温度升高, 酶蛋白会逐渐变性而失活, 引起酶反应速率下降[5]。不同蛋白酶都有其最适的酶反应温度, 但会受到酶的纯度、底物及pH值等因素的影响。

不同温度对酶解液多肽得率的影响见图1。

图1 不同温度对酶解液多肽得率的影响

从图1可以看出, 在50～65℃时, 酶解后多肽得率逐渐升高, 65℃时达到最高, 随着温度继续升高, 酶解作用逐渐减弱。因此, 最佳的酶解温度在65℃左右。

2.2.2 酶解pH值对多肽得率的影响

不同pH值温度对酶解液多肽得率的影响见图2。

图2 不同pH值温度对酶解液多肽得率的影响

从图2可以看出, 用木瓜蛋白酶酶解海参多肽最适pH值6.5左右, 随着pH值升高, 酶解活力也随之下降。每种酶都有最适pH值, 当偏离最适pH值时, 维持酶三维结构的共价键受到离子作用力的干扰, 从而会导致酶蛋白自身会发生变性。因此, 酶解pH值宜控制在6.5左右。

2.2.3 酶解时间对多肽得率的影响

在酶解的过程中, 并非酶解时间越长酶解效果越好, 还需要寻找最佳的酶解时间。

不同时间对酶解液多肽得率的影响见图3。

图3 不同时间对酶解液多肽得率的影响

从图3可以看出, 随着酶解时间的增加, 多肽得率逐渐增加, 在4～5 h趋于平稳, 随着时间的延长, 多肽得率又逐渐降低, 可能随着酶解反应的进行, 多肽进一步酶解成氨基酸, 从而降低酶解液中多肽的得率。因此, 酶解时间不宜太长, 以4 h为优。

2.2.4 加酶量对多肽得率的影响

不同加酶量对酶解液多肽得率的影响见图4。

从图4可以看出, 加酶量为4500 U/g时多肽得率达到最高, 随着加酶量的增加, 多肽得率逐渐降低。酶的用量大于最适浓度时, 过量的酶很难与底物接触, 不能提升对底物蛋白的水解。因此, 选用加酶量为4500 U/g。

图4 不同加酶量对酶解液多肽得率的影响

2.2.5 料液比对多肽得率的影响

不同料液比对酶解液多肽得率的影响见图5。

从图5可以看出, 随着物料比的增加, 多肽得率逐渐升高, 料液比1∶3时达到最高, 之后又逐渐降低, 主要可能是料液比大时体系水分较少, 底物黏稠, 酶解反应较慢, 随着水分增加, 酶与底物接触多, 水解速率增大, 但随着料液比的增加, 降低了体系中酶的浓度, 使得酶促反应速度下降, 水解度降低。因此, 料液比选择1∶3较为合适。

2.3 正交试验结果及分析

在单因素试验基础上, 以多肽得率为指标, 对料液比、酶解温度、酶解pH值等3个因素进行三因素三水平正交试验。

正交试验和结果分析见表4。

表4 正交试验和结果分析

在上述试验的基础上, 对海参酶解的主要因素（酶解温度、pH值、料液比）进行L9（34）正交试验, 正交试验结果表所示, 各因素的影响次序为酶解温度（A）＞料液比（C）＞pH值（B）, 得出理论的最优组合为A2B3C2, 即酶解温度为65℃, pH值为6.5, 料液比为1∶4。根据正交试验结果可以看出, 试验最佳组合为A2B3C1, 通过试验验证比较, 确定最优酶解工艺为A2B3C2, 即酶解温度为65℃, pH值为6.5, 料液比为1∶4, 酶解时间为4 h, 加酶量为4500 U/g。

最优试验组合验证见表5。

表5 最优试验组合验证

3 结论

试验以红极参为原料制备海参多肽, 以多肽得率为指标, 筛选最优蛋白酶, 分别研究了酶解温度、酶解时间、酶解pH值、加酶量、料液比对海参酶解液多肽得率的影响, 并在单因素试验基础上, 设计正交试验优化确定最佳酶解工艺为酶解温度65℃, pH值6.5, 料液比1∶4, 酶解时间4 h, 加酶量4500 U/g, 此时酶解多肽得率为15.40%, 为海参肽产品开发提供一定的理论指导。