木姜叶柯种质资源评价及其黄酮物质生物合成调控研究进展

邱小燕, 肖深根, 李自强, 王依清, 陈阳峰, 向助文

（1.湖南农业大学园艺学院, 湖南长沙 410128；2.湖南瑶茶工程技术研究中心, 湖南溆浦 419300；3.湖南翱康生物科技有限公司, 湖南溆浦 419300；4.怀化学院生物与食品工程学院, 湖南怀化 418000）

木姜叶柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）俗称“甜茶”, 长江以南各省区均有分布, 其中湖南、江西等省资源尤为丰富[1]。《全国中草药汇编》记载“木姜叶柯可用于防治痈疽恶疮、皮肤瘙痒和温热痢疾等症状”[2]。民间以木姜叶柯嫩叶作为甜茶饮用已有悠久的历史, 其味甘甜持久、香气浓郁。现代药理学研究表明, 木姜叶柯中的主要有效成分为黄酮物质, 具有降三高、抗氧化等作用[3-6]。木姜叶柯既是我国民族珍贵药材, 又被批准为色素添加剂和新食品原料资源, 兼具药、茶、糖的功能, 极具开发价值。近年来, 随着木姜叶柯产业的发展, 由于野生木姜叶柯是高大的乔木, 很多地方都以砍伐野生木姜叶柯来获取嫩叶。因此, 木姜叶柯野生分布面积逐年降低, 造成木姜叶柯种群和个体数减少, 其种内遗传多样性丢失, 最终不利于植物的生存；同时, 黄酮物质又是木姜叶柯叶片提取物的主要活性成分, 因此建立木姜叶柯种质资源圃, 筛选优异种质, 探明木姜叶柯黄酮物质的生物合成调控机制极为重要。综述了木姜叶柯种质资源及其黄酮物质生物合成调控的研究进展, 展望了木姜叶柯未来研究的方向。

1 木姜叶柯种质资源研究现状

1.1 2种“甜茶”的基源比较

木姜叶柯和广西甜茶都俗称“甜茶”, 民间饮用历史悠久, 都是高甜、低热、无毒的天然甜味剂, 具有解渴生津、防治糖尿病和降血压等功效, 容易混淆, 虽然都俗称“甜茶”, 但是它们的区别非常大。木姜叶柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）是壳斗科柯属的常绿乔木, 叶片为革制、互生, 幼芽紫褐色、披短绒毛, 成熟叶皮为灰褐色、叶片呈卵状、基部楔形、先端渐尖, 主要含黄酮类、三萜类及其他化合物, 其总黄酮含量高达10%, 主要集中在叶部, 其甜味成分主要是二氢查耳酮类[7-8]。广西甜茶（Rubus Suavissimuss S.Lee）是蔷薇科悬钩子属多年生落叶灌木, 叶片和枝条稍软, 幼苗紫红色, 成熟叶为绿色, 先端弯垂[9], 主要含甜茶素、黄酮、茶多酚等活性成分, 其主要甜味成分是甜茶素, 含量达1.5%, 嫩叶中总黄酮为0.35%, 老叶中总黄酮为0.022%, 其黄酮物质主要是槲皮素和山奈酚[10]。

1.2 不同采收期木姜叶柯黄酮物质含量变化规律

木姜叶柯在不同采收期的黄酮物质含量差异较大。刘灿明等人[11]研究了湖南涟源野生木姜叶柯总黄酮含量在3月份为11.46%, 4月份为14.60%, 5月份为9.60%, 4月份的总黄酮含量最高。廖晓峰等人[12]测定了江西武夷山的木姜叶柯总黄酮含量在4月份高达22.2%。李胜华等人[13]对湖南芷江的木姜叶柯嫩叶中的总黄酮研究表明, 从4—12月呈先上升后下降的趋势, 夏末初秋即（6-9）月的总黄酮含量最高达9.87%, 10月份开始降低, 12月份最低。徐兰芳[14]研究了江西吉安木姜叶柯老叶中总黄酮含量的变化规律, 在8和9月份达到峰值25.51%和23.45%, 在2月和4月分别有2个小峰值, 为16.08%和14.82%。游晓莹[15]研究木姜叶柯嫩叶中的根皮苷和三叶苷在不同采收期的变化规律, 根皮苷含量在7月份达到最高峰（5.7%）, 而后下降至9月达到最低谷（2.27%）, 然后又在11月达到一个次高峰（5.6%）, 然后呈下降的趋势, 三叶苷则在7月含量最高达4.5%, 5, 6, 7月均检测不到三叶苷, 其他月份的含量均在1%以下。徐兰芳[14]对江西吉安的木姜叶柯老叶中的根皮苷和三叶苷在不同采收期的变化规律, 根皮苷在2, 4, 7, 10月出现峰值, 分别为7.33%, 8.07%, 7.52%和8.17%。三叶苷则在3, 6, 10月达到峰值分别为0.82%, 0.98%和1.19%。综上所述, 若以总黄酮含量作为采收质量评价指标, 嫩叶宜在4月和6—9月采收, 老叶宜在2月和6—10月采收；若以根皮苷含量作为采收质量评价指标, 嫩叶宜在7月采收, 老叶宜在2, 4, 7, 10月采收；若以三叶苷含量作为采收质量评价指标, 嫩叶宜在7月采收, 老叶宜在3, 6, 10月采收。前期研究表明, 不同采收期黄酮物质含量差异较大；然而, 木姜叶柯不同采收期黄酮物质合成累积差异的机制尚未探明, 需要进一步研究。

1.3 不同种源木姜叶柯黄酮物质含量比较

不同种源对木姜叶柯黄酮物质含量的影响也较大。徐兰芳[14]在5月份比较广东广州和广东惠州2个不同种源的根皮苷和三叶苷含量, 结果表明惠州的根皮苷含量较低, 三叶苷则高达6.06%, 广州的三叶苷含量较低, 根皮苷含量则高达4.27%。何平等人[16]对江西分宜、四川米易、湖南溆浦、重庆北碚和广西田林5个种源木姜叶柯叶片的黄酮物质进行了比较, 存在极显著差异, 其中总黄酮含量最高的资源为江西分宜（8.16%）, 根皮苷含量最高的资源为重庆北碚（6.44%）, 三叶苷含量最高的资源为四川米易（2.99%）。王坤等人[17]对6个省份的30个木姜叶柯种源进行了老叶根皮苷和嫩叶三叶苷含量的测定, 其中根皮苷含量最高的资源为广西, 老叶中高达16.29%, 三叶苷含量最高的资源为重庆, 嫩叶中高达31.41%。上述结果表明, 不同种源的木姜叶柯黄酮物质含量具有极大的差异, 但是上述研究中的材料均取自种源地, 并没有将资源移至同一个资源圃, 黄酮物质的含量受到环境因素的影响较大。因此, 建立木姜叶柯种质资源圃, 消除环境因素的影响, 在当地的生态环境下, 根据不同需求筛选优异种质显得尤为重要。

1.4 不同种源木姜叶柯遗传多样性分析

木姜叶柯遗传基因的种源变异是影响木姜叶柯黄酮物质含量的关键因素。Cheng J等人[18]利用11个SSR分子标记研究了浙江、重庆、广西、江西、湖南和福建6个省份共11个种群的遗传变异和种群结构, 结果表明大部分变异发生在种群内, 木姜叶柯种群间没有发生较大的遗传变异, 遗传距离可能与地形相关, 与地理距离之间没有相关性。综上所述, 前期的研究还缺乏云贵高原、陕西和福建等典型高原地形、高纬度、低海拔山地等具有代表性的种质资源, 且没有进行木姜叶柯的有效成分与遗传多样性的关联分析, 同时也没有研究木姜叶柯的系统进化, 这些在后续的科研工作中都值得研究。

2 木姜叶柯黄酮物质生物合成调控研究进展

2.1 木姜叶柯植物中黄酮物质生物合成途径及关键酶

基因是影响木姜叶柯生理机制的内在遗传因素, 黄酮类化合物的生物合成是一个复杂的调控网络, 涉及到多个关键基因和关键酶。有研究表明, 植物体内黄酮类化合物的生物合成基本途径（见图1[19]）, 首先由乙酰CoA合成丙二酰CoA, 再由莽草酸途径获得对-香豆酰CoA, 对-二氢香豆酰CoA由对-香豆酰CoA在还原酶催化作用下得到, 根皮素由对-二氢香豆酰CoA与丙二酰CoA在查尔酮合成酶的催化作用下得到, 根皮苷由根皮素在糖基转移酶的催化作用得到[20]。宋菊等人[21]对木姜叶柯进行了转录组测序并挖掘到黄酮合成相关基因28条, 除了查尔酮异构酶和合成酶等关键酶基因, 还有苯丙氧酸解氨酶、乙酰辅酶A羧化酶、花青素合成酶等重要酶基因。尹峰等人[22]克隆了木姜叶柯黄酮3-羟化酶基因, qRT-PCR验证表明, 木姜叶柯黄酮3-羧化酶基因在根、茎、叶柄和叶片中的表达量差异显著, 其中叶片表达量最高, 是最低表达根部的6.7573倍。林丽梅等人[23]克隆了木姜叶柯的查尔酮异构酶基因, 该基因在木姜叶柯的叶片、叶柄、茎和根中的表达量差异显著, 其中叶片相对表达量最高, 是最低表达部根的9.75倍。邢朝斌等人[24]克隆了木姜叶柯4-香豆酸辅酶A-连接酶基因木姜叶柯4-香豆酸辅酶A-连接酶基因在除根以外的各个器官中均表达, 且根皮苷含量与该酶的表达量呈显著正相关, 在叶片中表达最高。朱金丽等人[25]克隆了木姜叶柯的无色花青素还原酶基因, 该基因的表达量与木姜叶柯根皮苷含量呈显著正相关, 无色花青素还原酶基因的表达可以促进根皮苷的积累。综上, 木姜叶柯黄酮类化合物的生物合成受到多种基因的共同调控。因此, 更加深入地研究木姜叶柯黄酮生物合成基因调控网络, 构建出完整的木姜叶柯黄酮代谢调控网络对提高木姜叶柯品质及实现木姜叶柯黄酮的大量合成具有重要意义。

植物黄酮物质生物合成基本途径[18]见图1。

图1 植物黄酮物质生物合成基本途径

2.2 光照对木姜叶柯黄酮物质生物合成调控的影响

黄酮物质是木姜叶柯是适应环境因子的产物, 在一定的环境胁迫下被诱导表达黄酮合成的相关酶基因, 关键酶催化黄酮物质的合成[26]。光照会影响光合作用和信号转导, 也会影响黄酮物质的合成[27]。伍贤进[28]研究表明, 遮光40%的叶片中黄酮含量最高, 遮光80%的叶片中黄酮含量最低, 说明适当的遮光有利于木姜叶柯叶中总黄酮的积累, 但遮光太多, 总黄酮的积累又受到一定的抑制。随着遮光时间的持续, 叶片中黄酮的含量由逐渐升高而转变为逐步下降, 在遮光60 d时各处理中叶中总黄酮的含量均达到最高。光质对植物的各项生命活动至关重要, 不同光质可触发植物体内不同的光受体来感知, 以此来调控黄酮物质的合成与积累。张妍彤[29]研究表明, 在红光和蓝光培养条件下, 木姜叶柯根皮苷含量均降低, 给与绿光刺激可促进根皮苷的积累, 在低强度（1000 lx）处理时, 根皮苷含量增加, 在高强度（2000 lx和3000 lx）处理时降低, 日光照8 h和11 h培养时根皮苷含量降低, 而日光照14 h培养时根皮苷含量增加, 可以提高3.49%, 表明适当延长绿光光照时间有提高根皮苷含量的可能。因此, 可以考虑采用绿光对木姜叶柯进行低光强长时间的微胁迫处理, 来诱导黄酮物质的积累。一般短时间内微胁迫处理难以达到显著效果, 是否可以通过采用短期的强绿光胁迫处理来模拟放大前期微胁迫, 值得研究。

3 结语

木姜叶柯作为新资源食品原料, 有着广阔的市场前景。在木姜叶柯种质资源及黄酮物质生物合成方面仍然需要深入研究, 主要有：①木姜叶柯黄酮物质种源遗传变异研究需要更加全面；②木姜叶柯黄酮物质合成关键酶基因需要进一步挖掘；③栽培措施对木姜叶柯黄酮物质合成的影响需进一步研究。总之, 需要多角度对木姜叶柯进行综合和可持续发展的研究, 推动木姜叶柯产业的发展。