基于矿物元素的西藏自治区牦牛肉产地溯源研究

宗万里刘海金赵姗姗陈爱亮赵 燕

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081；2.威海市食品药品检验检测研究院，山东威海 264210；3.西藏自治区农畜产品质量安全检验检测中心，拉萨 850211）

西藏自治区是我国牦牛的主产地之一，由于其特殊的地理条件和生态环境，形成了九龙牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛、类乌齐牦牛、嘉黎牦牛等特有的类群，不同地域牦牛肉的品质和口感存在很大的差异。为防止西藏自治区存在低质量牦牛肉假冒高品质牦牛肉的现象，针对不同产地牦牛肉的肉品性状和颜色极为相似以及肉眼很难区分的问题，有必要对不同地域牦牛肉产地鉴别技术进行研究。目前基于矿物元素分析的产地溯源技术已经应用于畜产品[1～12]、 乳及乳制品[13～17]、 水产品[18～19]、 水果[20～22]、谷物[23～29]、 中药材[30～31]、 蔬菜[32～33]、 茶 叶[34]等产地溯源研究中。选择矿物元素进行溯源的依据是不同地域环境中矿物元素含量存在差异，从而导致植物中矿物元素含量存在差异，进而以植物为饲料的动物体内矿物元素含量存在差异。本研究以西藏自治区4个不同地区的100个牦牛肉样本为实验材料，利用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP－OES）、电感耦合等离子体质谱仪（ICP－MS）分析4个不同地区牦牛肉样品中的矿物元素组成差异特征。通过牦牛肉中矿物元素差异，利用化学计量学方法，建立区分西藏自治区不同产地牦牛肉的判别模型，对不同产地牦牛肉进行判别，旨在为西藏自治区不同产地牦牛肉的溯源提供参考依据。

一、材料与方法

（一）材料与 试剂钾 （K）、钠 （Na）、钙（Ca）、镁 （Mg）、铝 （Al）、铁 （Fe）、铜 （Cu）、锌（Zn）、钒 （V）、铬 （Cr）、锰 （Mn）、钴 （Co）、镍（Ni）、镓 （Ga）、砷 （As）、硒 （Se）、铷 （Rb）、锶（Sr）、银（Ag）、镉（Cd）、钡（Ba）、铊（Tl）、铅（Pb）、钇 （Y）、镧 （La）、铈 （Ce）、镨 （Pr）、钕 （Nd）、钐（Sm）、铕（Eu）、钆（Gd）、铽（Tb）、镝（Dy）、钬（Ho）、铒（Er）、铥 （Tm）、镱（Yb）元素标准溶液，100 μg/mL，国家有色金属及电子材料分析测试中心；钛（Ti）、锡（Sn）、锑（Sb）元素标准溶液，10 μg/mL，安捷伦科技（中国）有限公司；实验用水均为GB/T 6682规定的一级水；硝酸（色谱纯），德国Merck公司；三氯甲烷（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；双氧水（优级纯），国药集团化学试剂有限公司；玻璃培养皿，直径6 cm，上海五一玻璃仪器厂；刻度消解管，50 mL，美国EE公司。

（二）仪器与设备GM 300型刀式研磨仪，德国莱驰公司；MARS 6型微波消解仪，美国培安公司；7900型电感耦合等离子体质谱仪，美国安捷伦公司；7400型电感耦合等离子体发射光谱仪，美国赛默飞世尔公司；Practum 1102－1 CN型电子天平，德国赛多利斯公司；SCIENTZ－48型高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；Comfort II型超纯水机，德国赛多利斯公司；EHD－16型电热赶酸仪，北京东航科仪仪器有限公司；FD260型干燥箱，德国宾得公司；UMV－2型多位涡旋振荡器，烟台盈聚仪器仪表有限公司；Z216MK型冷冻离心机，德国Hermle公司。

（三）方法

1.样品采集。采集的牦牛肉样品来自西藏自治区的拉萨达孜、阿里、昌都类乌齐和日喀则亚东，样品详细信息见表1。

表1 采集的牦牛肉样品的地理及其环境信息

2.样品前处理。取经粉碎的牦牛肉样品15.0 g左右平摊于平皿中，然后放到干燥箱中（70℃）干燥48 h，取干燥的样品用高通量组织研磨器（参数设置为50 Hz、300 s）磨成粉。将磨成粉的牦牛肉样品进行脱脂，脱脂的步骤为称取0.3 g牦牛肉粉至2 mL离心管中，加入1.5 mL三氯甲烷－甲醇（2∶1，体积比）溶液，置于离心管并盖紧盖子。将离心管放入多位涡旋振荡器，以2 500 r/min的速度振荡10 min。振荡结束后，在12℃的温度下以5 000 r/min的速度离心5 min。用移液枪吸取上清液至废液瓶中。再重复脱脂两次，将脱脂后的样品置于干燥器中干燥。

称取0.2 g干燥后的样品至微波消解管中，加入7 mL硝酸、1 mL双氧水，采用微波消解法消解。微波消解程序为从室温升至120℃（20 min），保持20 min，从120℃升至200℃（15 min），保持30 min，功率为1 400 W。

待消解完成后将消解管取出置于电热赶酸仪上110℃赶酸2 h，冷却后将消解液转移至刻度消解管中，用纯水少量多次润洗消解管内壁并转移至同一刻度消解管中，再用纯水定容至25 mL，作为上机测试溶液。

元素K、Na、Ca、Mg、Al、Fe、Cu、Zn使用电感耦合等离子体发射光谱法检测，其他元素V、Cr、Mn、Co、Ni、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba、Tl、Pb、Ti、Sn、Sb、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb使用电感耦合等离子体质谱法检测[35～36]。

3.仪器条件。电感耦合等离子体发射光谱、电感耦合等离子体质谱的仪器条件分别见表2和表3。

表2 电感耦合等离子体发射光谱条件

表3 电感耦合等离子体质谱条件

4.检出限及定量限。40种矿物元素的检出限及定量限见表4。

表4 40种矿物元素检出限及定量限

5.统计学分析。应用统计学软件SPSS 22.0（IBM公司）和SIMCA 14.1（Umetrics公司）对不同产地牦牛肉的元素含量进行多重方差分析、聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS－DA）和基于正交信号校正的偏最小二乘判别分析（OPLS－DA）。

二、结果与分析

（一）不同地区牦牛肉中矿物元素含量差异分析对西藏自治区4个不同产地耗牛肉样品中的40种矿物元素含量进行方差分析，分析结果见表5。由表5可知，牦牛肉样品中Mg、K、Na、Ca、Zn、Cu、Al、Fe、Mn、Cr、Ni、Ga、Se、Rb、Sr、Ba、Pb、Ti、Sn含量较高，V、Co、As、Ag、Cd、Tl、Sb、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb含量较低。

表5 西藏自治区4个不同产地牦牛肉中矿物元素方差分析

牦牛肉样品中Er含量在4个产地间存在显著差异（P<0.05），Na、Cu、Fe、Ga、As、Se、Rb、Cd、Ba、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Tm共20种矿物元素的含量在3个产地间存在显著差异，Mg、K、Al、Zn、V、Cr、Mn、Co、Ni、Ag、Tl、Pb、Ti、Sn、Sb、Tb、Yb共17种矿物元素的含量在2个产地间存在显著差异（P<0.05），元素Ca、Sr含量差异不显著。拉萨达孜的牦牛肉样品中K、Na、Cu、Rb、Cd、Ba、Pb、Sn、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Tb、Dy、Ho、Er、Tm含量高于其他3个产地，Fe、V、Cr、Co、Ni、Ga、Se、Ag低于其他3个产地；阿里的牦牛肉样品中Zn、Fe、Mn、As、Sb含量高于其他3个产地，Rb、Cd、Tl、Tb含量低于其他3个产地；昌都类乌齐的牦牛肉样品中Mg、Cr、Ni、Ga、Se含量高于其他3个产地，Cu、Al、Mn、As、Ba、Pb、Ti、Sn、Sb、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm、Yb含量低于其他3个产地；日喀则亚东的牦牛肉样品中Al、V、Co、Ag、Tl、Ti、Y、Gd含量高于其他3个产地，Mg、K、Na、Zn含量低于其他3个产地。综上，在测定的40种元素中存在差异的有38种，不同产地的牦牛肉样品中矿物元素含量有其各自的特征，说明基于矿物元素分析对牦牛肉产地进行判别是可行的。

动物体内矿物元素含量受水、植物的影响[37]，水、植物中矿质元素的积累与环境中矿物元素含量呈一定相关性[38]，动物体内的矿物元素含量与周围的环境有一定相关性。西藏自治区的牦牛肉中稀土元素含量低，与地理环境有关，我国土壤中稀土元素的含量由南向北和由东向西呈逐渐降低的态势[39]。从矿物元素含量差异分析结果可以看出，西藏自治区不同产地牦牛肉中矿物元素含量存在差异。牦牛肉中含量较高的元素Mg、K、Na、Zn、Cu、Al、Fe、Mn、Cr、Ni、Ga、Se、Rb、Ba、Pb、Ti、Sn在不同产地之间存在差异，这可能是由土壤中可利用的矿物元素含量差异引起的。但是，这些元素中没有一种元素同时在4个产地之间存在差异，说明单纯利用方差分析不能较好地对不同产地牦牛肉进行区分，需要利用其他分析方法对数据进行分析。

（二）聚类分析聚类分析是归类划分数据中相似性数据的统计方法[33]，是将样本根据其特征的相似性逐步聚合，把相似度最大的优先聚合在一起，最后根据类别的综合性对多个类别进行聚合，从而完成聚类分析的过程[40]。近年来，聚类分析越来越多地应用于农产品产地溯源[41～45]。本研究对38种存在含量显著差异的矿物元素进行基于欧式距离的层次聚类分析，产生的聚类树状图见图1。图1横坐标样品编号中LS代表来自拉萨达孜的样品、CD代表来自昌都类乌齐的样品、RKZ代表来自日喀则亚东的样品，AL代表来自阿里的样品。将聚类距离200作为分割线，4个产地的牦牛肉样品可被分为4类。其中阿里的牦牛肉样品归属一类，有个别拉萨达孜牦牛肉样品归属到这一类中；昌都类乌齐的牦牛肉样品归属一类，有日喀则亚东的个别牦牛肉样品分类至这类中；拉萨达孜和日喀则亚东的样品各自归为一类，但分别有少数样品归到其他类。可见，基于矿物元素含量的聚类分析为牦牛肉产地鉴别提供了可能，但仍存在交叉现象。

图1 基于矿物元素的4个产地牦牛肉HCA图

（三）主成分分析主成分分析是利用降维的思想，在损失很少信息的前提下，把多个指标转化为几个综合指标的多元统计方法[46]。通过主成分分析结果可以判断筛选的特征元素的差异情况。本研究对在牦牛肉中具有产地间显著差异的38种元素进行主成分分析，共提取了38个主成分，其中初始特征值大于1的主成分有8个，累积方差百分比为79.525%（见表6），表明8个主成分包含了原始变量中79%以上的信息，可代表大部分数据特征。第1主成分主要综合了牦牛肉样品的Al、V、Ba、Ti、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm和Yb共17种 元素 含 量信息；第2主成分主要综合了牦牛肉样品的Fe、V、Cr、Mn、Co、Ni、Ga、Sb共8种元素含量信息；第3主成分主要综合了牦牛肉样品的V、Cr、Co、Ni、Ga、Tl共6种元素含量信息；第4主成分主要综合了牦牛肉样品的Cu、Rb、Pb、Sn共4种元素含量信息；第5主成分主要综合了牦牛肉样品的Mg、Rb和Pb共3种元素含量信息；第6主成分主要综合了牦牛肉样品的Na、Ag和Cd共3种元素含量信息；第7主成分主要综合了牦牛肉样品的Mg元素含量信息；第8主成分主要综合了牦牛肉样品的K元素含量信息。

表6 总方差解释

在主成分分析中，利用第1主成分、第2主成分得到得分图（见图2）。由图2可以看出，4个产地牦牛肉样品区分不够明显，日喀则亚东的牦牛肉样品与拉萨达孜、阿里的牦牛肉样品存在交叉的情况；拉萨达孜有3个样品落在置信椭圆外，其中有1个样品与同产地其他样品相距较远；日喀则亚东有两个样品落在置信椭圆外，与同产地其他样品相距较远；阿里有3个样品落在置信椭圆外，与同地区其他样品相距较远。从地理位置上看，日喀则亚东与阿里和拉萨达孜的距离较近，与昌都类乌齐的距离远，在图2中可以看到日喀则亚东的样品与昌都类乌齐的样品区分明显，而与拉萨达孜和阿里的样品区分效果较差，其分散在拉萨达孜和阿里的样品之间。

图2 基于矿物元素的4个产地牦牛肉PCA得分图

（四）判别分析

1.Fisher判别模型。基于牦牛肉产地进行元素差异分析、聚类分析和主成分分析后可以看出，利用矿物元素的含量对牦牛肉产地溯源具有一定可行性。为进一步了解各矿物元素含量指标对牦牛肉产地判别的作用及效果，对在产地间存在差异的38种矿物元素，用Fisher函数建立判别模型，进行判别分析。判别分析是一种有监督的数据分类方式。其可利用各类样品之间的相关性建立判别模型而对未知样品进行分类，还可利用交叉验证把除某一个样品之外的其余样品作为训练集，进而建立判别函数对该样品进行判别，从而检验判别模型的稳定性。

本研究在Fisher判别分析中，对样品进行了原始判别分析和交叉验证分析。结果显示，来自拉萨达孜、阿里、昌都类乌齐、日喀则亚东的牦牛肉的原始正确判别率均为100%，总体原始正确判别率为100%；来自拉萨达孜的牦牛肉的交叉验证正确判别率为100%，来自阿里的牦牛肉的交叉验证正确判别率为96.7%，来自昌都类乌齐的牦牛肉的交叉验证正确判别率为97.7%，来自日喀则亚东的牦牛肉的交叉验证正确判别率为94.1%，总体交叉验证正确判别率为97%。可见西藏自治区不同产地的牦牛肉，借助于矿物元素能够进行有效的产地判别。

2.偏最小二乘法判别分析。偏最小二乘法判别分析是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，是特征投影显示方法的一种，可揭示自变量（X）和因变量（Y）之间的模型关系[47]。为综合分析牦牛肉不同产地间的差异性，去掉0值较多的Tb元素，将剩余的39个元素含量输入SIMCA 14.1分析软件，建立有监督模式的PLS－DA模型。提取2个主成分，模型解释率参数R2Y为0.559，模型预测率参数Q2为0.537。经PLS－DA模型分析分别生成得分图、载荷图和变量重要性投影值图（VIP图），分别见图3～图5。

图3 基于矿物元素的4个产地牦牛肉PLS－DA得分图

图3中的每个点代表1个样品，聚合程度反映同一产地牦牛肉样品间相似度。由图3可知，PLS－DA模型中数据点均在95%置信区间内，聚合程度较好，但日喀则亚东牦牛肉样品与拉萨达孜以及昌都类乌齐牦牛肉样品存在交叉现象。

图4中每1个点代表1种元素，距离原点越远的点权重值越大，决定样本差异的作用越大。图5中的VIP值可反映变量（元素）对模型分类的整体贡献度，PLS－DA模型中变量VIP值＞1.0说明该变量对整体模型的贡献度高于平均水平。由图5可知，As、Tl、Rb、Ag、Se、Sb、Mn、Cd、Cr、Fe、Na、Ni、Y、Ga、Co贡献度较大，这些元素可能是不同产地牦牛肉的主要标志性元素。

图4 基于矿物元素的4个产地牦牛肉PLS-DA载荷图

图5 PLS-DA模型的元素VIP值分布情况

3.基于正交信号校正的偏最小二乘判别分析。按和PLS－DA同样的方法建立有监督模式的OPLS－DA模型。提取2个主成分，模型解释率参数R2Y为0.709，高于0.5，说明所建模型具有较强的解释率；模型预测率参数Q2为0.596，大于0.5。经OPLS－DA模型分析分别生成得分图、载荷图和变量重要性投影值图（VIP图），分别见图6～图8。

图6 基于矿物元素的4个产地牦牛肉OPLS-DA得分图

图8 OPLS-DA模型的元素VIP值分布情况

从图6中可以看出，基于牦牛肉中矿物元素含量构建的OPLS－DA模型可以明显区分拉萨达孜、阿里、昌都类乌齐、日喀则亚东4个产地的牦牛肉样品。OPLS－DA模型中数据点均在95%置信区间内，且聚合程度与区分性均优于PLS－DA模型，说明在区分4个不同产地牦牛肉样品的元素含量差异性上，OPLS－DA构建的判别模型效果更好。

与PLS－DA类似，图7中每个点代表1种元素，距离原点越远的点权重值越大，决定样本差异的作用越大。图8中变量（元素）VIP值＞1.0说明该变量（元素）对OPLS－DA模型的贡献度高于平均水平。由图8可知，Tl、As、Ag、Se、Cr、Rb、Ni、Mn、Sb、Co、Ce、Al、Y、Pr、Fe、La、Ga、Cd、V、Na、Er贡 献 度 较 大，这 些 元 素 具 有 在OPLS－DA模型中作为判别产地差异元素的潜力。

图7 基于矿物元素的4个产地牦牛肉OPLS-DA载荷图

在判别分析中，Fisher判别分析、PLS－DA、OPLS－DA均能较好实现对4个产地牦牛肉样品的区分，其中Fisher判别分析和OPLS－DA比PLSDA的区分效果好。在牦牛的产地溯源中，项洋等[48]利用稳定同位素与矿物元素相结合的方法实现了对青海省大通县、四川省红原县、四川省九龙县、青海省河南县牦牛肉的区分，选用了δ13C、δ2H、Ti，总体正确分类率为85%，交叉验证率为82.5%。本研究进一步证实了利用矿物元素分析技术结合化学计量学的方法能够实现对同一省内不同产地牦牛肉的产地溯源。

三、结论

本研究采用基于电感耦合等离子质谱法和电感耦合等离子体发射光谱法的矿物元素分析技术，对拉萨达孜、阿里、昌都类乌齐、日喀则亚东4个产地100个牦牛肉样品中的40种矿物元素进行了测定，并进行多重方差分析、聚类分析、主成分分析和判别分析等化学计量学分析，实现了对西藏自治区不同产地牦牛肉的区分，并成功建立了判别模型。由分析结果可知，多重方差分析、聚类分析、主成分分析能够对4个产地的牦牛肉进行一定程度的区分。Fisher判别分析可以有效判别牦牛肉产地，其总体原始正确判别率为100%，交叉验证正确判别率为97%。建立的PLS－DA数据模型和OPLS－DA数据模型可对牦牛肉产地实现有效的区分，其中OPLS－DA模型的区分效果优于PLSDA模型。本研究结果证明了利用矿物元素分析技术建立的产地溯源模型可对来自我国西藏自治区拉萨达孜、阿里、昌都类乌齐、日喀则亚东4个产地的牦牛肉进行有效的产地判别，矿物元素分析技术在西藏自治区牦牛肉产地溯源应用方面具有可行性。