我国大蒜地理标志产品特征品质差异研究

刘秀华刘平香赵旭影王贤贤刘天择张继光翁 瑞钱永忠

（1.中国农业科学院烟草研究所，农业农村部烟草质量安全风险评估实验室，山东青岛 266101；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081；3.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，山东省食品质量安全监测技术重点实验室，济南 250100）

大蒜（Allium sativumL.）是百合科葱属植物中可以形成地下鳞茎的一个种，又名蒜、胡蒜等。大蒜的整棵植株均具有强烈的辛辣味，其蒜薹、蒜苗和鳞茎均可食用，此外还可作药用，是重要的药食两用植物[1]，其中含硫化合物是大蒜呈现抗菌、消炎、防癌抗癌等药理活性的物质基础[2～4]。我国已有2 000多年的大蒜种植历史，也是世界上最大的大蒜种植和出口国。截至2022年2月25日，已有37个大蒜相关产品申请了地理标志农产品，其中大蒜鳞茎产品34个、蒜薹2个、蒜苗1个，包括金乡大蒜、苍山大蒜、杞县大蒜等[5]。

地理标志产品，是指产自特定地域，所具有的质量、声誉或其他特性本质上取决于产地的自然和人文因素，经审核批准以地理名称进行命名的产品，是国内外知识产权保护（尤其是针对农产品和食品的知识产权保护）的重要部分[6～7]。地理标志产品对当地的农产品不仅可以起到一定的保护、宣传作用，而且在一定程度上可以提高农产品的市场竞争力，促进当地的经济发展[8～10]。大蒜地理标志产品能成功提高当地大蒜的知名度，为当地的农业可持续性发展及带动当地经济发展作出贡献。

研究发现，品种和产地是影响大蒜品质的重要因素之一。笔者团队前期通过对我国6个大蒜主产省份不同产地、品种大蒜的分析，发现不同地区和品种的大蒜间的品质成分含量有显著差异，S－甲基－L－半胱氨酸（SMC）、色氨酸、γ－氨基丁酸（GABA）、酪氨酸、精氨酸和苏氨酸是不同省份大蒜之间的主要差异成分[11]。此外，国内外众多学者研究发现不同产地、品种和不同表皮颜色大蒜中的可溶性糖、淀粉、蛋白质和含硫化合物等均有差异[12～14]，许多研究工作也正是基于此对不同品种和产地的大蒜开展鉴别分析和溯源[15～16]。

本文拟采用前期建立的超高相液相色谱－串联质谱（UHPLC－MS/MS）法作为检测方法[17～18]，通过结合监督和非监督模式的多元统计分析方法[19～21]，分析我国大蒜地理标志产品中的含硫化合物和氨基酸等品质成分，剖析大蒜地理标志产品的品质成分含量差异及特征品质差异，以期为大蒜品种改良和功能成分深加工提供相应基础数据。

一、材料与方法

（一）仪器与试剂QuSEL平行研磨仪E0301［微思行（北京）科技有限公司］；分析电子天平［梅特勒－托利多仪器 （上海）有限公司］；SCDEALLVX-III多管涡旋振荡仪（北京踏锦科技有限公司）；离心机（美国Thermo Fisher公司）；Milli-Q水纯化系统（美国Millipore公司）；UHPLC Dionex Ultimate 3000系统（美国Thermo Fisher公司）；UPLC BEH C18柱（美国Waters公司，2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；QTRAP 6500+液相色谱－三重四极杆/线性离子阱质谱仪（美国AB SCIEX公司）；Xbridge C18柱 （美国Waters公司，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）。

甲基蒜氨酸、γ－L－谷胺酰－S－甲基－L－半胱氨酸（GSMC）和S－（反－1－丙烯基）－L－半胱氨酸（SPC）由北京思源勇拓科技有限公司合成，纯度均大于95%。γ－L－谷胺酰－S－烯丙基－L－半胱氨酸（GSAC，纯度98%）购自美国U.S.Pharmacopeia公司。蒜氨酸（纯度96.9%）、S－烯丙基－L－半胱氨酸（SAC，纯度95.0%）、SMC（纯度95.0%）和21种氨基酸，包括蛋氨酸（纯度≥99.0%）、甘氨酸（纯度≥99.0%）、缬氨酸（纯度≥98.0%）、色氨酸（纯度99.5%）、组氨酸（纯度99.0%）、半胱氨酸（纯度98.0%）、丝氨酸（纯度≥99.0%）、亮氨酸（纯度99.9%）、异亮氨酸（纯度98.0%）、苯丙氨酸（纯度≥98.0%）、苏氨酸（纯度≥99.0%）、丙氨酸（纯度≥99.0%）、脯氨酸（纯度≥99.0%）、酪氨酸（纯度99.9%）、天冬 氨 酸 （纯 度≥99.0%）、天 冬 酰 胺 （纯 度99.0%）、精氨酸（纯度99.9%）、赖氨酸（纯度≥97.0%）、谷氨酰胺（纯度98.0%）、谷氨酸（纯度99.7%）和GABA（纯度≥98.0%），均购自天津阿尔塔科技有限公司。大蒜素标准品溶液 （11.1 mg/mL）购自美国Chromadex公司。甲酸和乙腈均为色谱级，分别购自德国Merck公司和美国Thermo Fisher公司。试验用水 （电阻率为18.2 MΩ·cm）采用Milli－Q水纯化系统纯化。

（二）样品采集共采集17份大蒜样品，样品采集具体信息见表1。每份样品不少于30个大蒜鳞茎，采样时记录采样地点等信息。

（三）样品前处理不破坏大蒜鳞芽的前提下除去大蒜鳞芽外衣，取大于300 g完好的大蒜鳞芽于液氮中速冻，然后在冷冻干燥机中以－70℃条件冷冻干燥。冻干后的样品研磨粉碎，过60目筛后于－80℃超低温冰箱中保存待测。用于检测大蒜素的样品的前处理方法参照WANG等[22]的方法，准确称取200 mg大蒜粉于50 mL离心管中，加入10 mL 4℃预冷水，迅速涡旋30 s，再加入10 mL预冷水，涡旋30 s。将混合提取液在4℃、10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜于进样小瓶，保存于4℃冰箱以备进样分析。检测除大蒜素外的其他28个化合物时，准确称取200 mg大 蒜粉于50 mL离 心管 中，加 入20 mL含0.1%甲酸的水溶液（pH<3），涡旋1 min后于10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液为原液，并同时将原液分别稀释20倍和400倍，过0.22 μm滤膜于进样小瓶，保存于4℃冰箱以备进样分析。根据需求选择合适的稀释浓度进样分析。

（四）检测方法大蒜素使用UHPLC Dionex Ultimate 3000系统进样分析，采用UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）进行色谱分离，柱温为28℃，流速为0.3 mL/min。流动相为水（A相）和甲醇（B相），50%的A相和B相等度洗脱。进样盘温度设为4℃，进样量为5 μL，检测波长为254 nm。其他28种化合物使用QTRAP 6500+液相色谱－三重四极杆/线性离子阱质谱仪进行分析。质谱采用正离子模式检测，离子源温度为550℃，喷雾电压为4 500 V，气帘气压力为0.24 MPa，雾化气压力为0.38 MPa，辅助加热气压力为0.38 MPa。按照笔者团队在前期研究中应用的质谱扫描模式和离子对信息[11]进行采集。采用Xbridge C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）进行色谱分离，柱温为40℃，流速为0.4 mL/min。流动相为含0.1%甲酸的水（A相）和含0.1%甲酸的乙腈（B相），梯度洗脱程序为0 min，98% A；2 min，98%A；14 min，2%A；15 min，2%A。进样盘温度设为4℃，进样量为5 μL。

（五）数据分析主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS－DA）等多元统计分析和方差分析（ANOVA）采用SIMCA 14.1软件进行，层次聚类分析（HCA）及热图采用Multi Experiment Viewer（MeV）软件绘制，雷达图采用Excel 2016绘制。

二、结果与讨论

（一）大蒜地理标志产品中品质成分总体含量水平情况我国17个大蒜地理标志产品中29种品质成分的含量范围、中位值、均值及标准偏差结果见表2。从表2中可以看出，所有品质成分含量水平均具有明显的差别。7种风味前体化合物中蒜氨酸的平均含量是最高的，为21 061.11 mg/kg dw，其次为甲基蒜氨酸、GSAC和GSMC，SAC、SMC和SPC含量则较低。美国药典[23]和印度药典[24]中分别规定，大蒜中的蒜氨酸含量不得低于0.5%和0.2%（以干重计），美国药典同时规定大蒜中的GSAC含量不得低于0.2%（以干重计）。由表2可知，我国大蒜地理标志产品中蒜氨酸和GSAC含量分别为1.01%～3.29%和0.20%～2.60%（以干重计），均高于印度药典和美国药典中的相关规定。在大蒜细胞破碎后，蒜氨酸酶被激活，蒜氨酸经蒜氨酸酶催化生成大蒜素。欧洲药典[25]中规定，大蒜中大蒜素含量不得低于0.45%（以干重计）。由表2可知，我国大蒜地理标志产品中大蒜素含量范围为0.56%～2.47%（以干重计）。由此可见，我国大蒜地理标志产品的品质整体比较高。

同时，由表2可得出，游离氨基酸中精氨酸的平均含量最高，为30 156.10 mg/kg dw，占21种氨基酸总量均值的60%以上；谷氨酰胺平均含量次之，为2 990.33 mg/kg dw；赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸和天冬酰胺的平均含量均超过1 000 mg/kg dw；GABA的含量最低。精氨酸属于条件必需氨基酸，对于孕妇妊娠期健康、胎儿的发育和婴幼儿的生长有重要作用[26]。异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸等8种必需氨基酸的总含量为1 936.07～10 386.28 mg/kg dw，其中赖氨酸的平均含量最高，为2 733.96 mg/kg dw。综上可知，我国大蒜地理标志产品中的游离氨基酸含量丰富，在食品或饲料的研发中可作为相关氨基酸深加工产品的优质原料。

表2 17个大蒜地理标志产品中29种品质成分的含量范围、中位值、均值及标准偏差 （mg/kg dw）

（二）不同大蒜地理标志产品品质成分差异情况对17个大蒜地理标志产品的29种品质成分数据进行多元素方差分析，各品质成分的显著性均远小于0.05，表明不同品种及不同产地的大蒜地理标志产品中品质成分含量均有较大差异，此29种品质成分均为区分17个大蒜地理标志产品的关键因素。进一步绘制雷达图（见图1），由雷达图可见，SAC和SPC在不同地区及品种的大蒜间的含量变化相似，其 中 山 东 地 区 的 大 蒜（DLBZ008、DLBZ 009、DLBZ010、DLBZ011）中SAC和SPC的含量最高，含量范围分别为60.34～189.07 mg/kg dw和85.99～158.98 mg/kg dw；河南地区大蒜（DLBZ 012、DLBZ013）、山西地区大蒜（DLBZ002、DLBZ 003）次之，其他地区大蒜中含量则相对较低。GSAC和GSMC在不同地区和品种大蒜间的含量变化相似，其中陕西地区的大蒜（DLBZ015）中GSAC和GSMC含量明显高于其他地区，含量分别为25 985.92 mg/kg dw和10 450.56 mg/kg dw。新疆吉木萨尔白皮大蒜（DLBZ017）的甲基蒜氨酸含量为29 966.29 mg/kg dw，远高于其他地区（2 794.80～15 568.41 mg/kg dw）。蒜氨酸在江西地区的临湖大蒜（DLBZ006）和上高紫皮大蒜（DLBZ 007）以及河南地区的杞县大蒜（DLBZ012）和临颍大蒜（DLBZ013）中含量相对较低，均在15 000 mg/kg dw以下；在山东地区的嘉祥红皮大蒜（DLBZ 010）和苍山大蒜（DLBZ009）以及陕西地区的兴平大蒜（DLBZ015）中的含量较高，均超过29 000 mg/kg dw。有研究表明，大蒜素的含量受蒜氨酸含量和蒜氨酸酶活性等因素影响[11]，且大蒜素含量与蒜氨酸含量之间成正相关，这一点在本文的结果中得到了印证。由图1G和图1H可知，大蒜素的含量与蒜氨酸的含量保持一致，江西地区的临湖大蒜（DLBZ006）和上高紫皮大蒜（DLBZ007）中的大蒜素含量相对较低，均低于9 000 mg/kg dw，而山东地区安丘两河大蒜 （DLBZ008）、苍山大蒜（DLBZ009）、嘉祥红皮大蒜（DLBZ010）和陕西地区兴平大蒜（DLBZ015）中大蒜素含量较高，均超过17 000 mg/kg dw。由此可见，不同地区和品种的大蒜地理标志产品中的含硫化合物（SAC、SMC、SPC、GSAC、GSMC、甲基蒜氨酸、蒜氨酸、大蒜素）含量差异较大，因此可以根据不同功效需求选择合适的品种来开发和加工相应的食用或药用产品。其中，山东和陕西地区大蒜的含硫化合物含量整体高于其他地区，更适合提取和加工大蒜精油、大蒜素、蒜氨酸、S－烯丙（烷）基－L－半胱氨酸亚砜类等含硫化合物相关产品。

由图1K和图1L可见，游离氨基酸的含量分布较为相似，陕西兴平大蒜（DLBZ015）的8种必需氨基酸和20种氨基酸总量（不包括GABA）均高于其他地区大蒜，分别为10 386.28 mg/kg dw和92 098.73 mg/kg dw；黑龙江阿城大蒜（DLBZ005）与山东安丘两河大蒜（DLBZ008）的8种必需氨基酸总量相似，约为5 200 mg/kg dw。GABA的含量分布与8种必需氨基酸总量和20种氨基酸总量有很大差异，山东地区的苍山大蒜（DLBZ009）和金乡大蒜（DLBZ011）中GABA含量较高，均超过12 mg/kg dw，而陕西地区的兴平大蒜（DLBZ015）含量则相对较低。因此，陕西兴平大蒜更适合用于除GABA外的氨基酸类产品的加工和研发，而山东的苍山大蒜和金乡大蒜更适合用于生产富含GABA成分的产品。

图1 17个大蒜地理标志产品中SAC（A）、SMC（B）、SPC（C）、GSAC（D）、GSMC（E）、甲基蒜氨酸（F）、蒜氨酸（G）、大蒜素（H）、8种含硫化合物总量（I）、GABA（J）、8种必需氨基酸总量（K）和20种氨基酸总量（L）的分布雷达图 （mg/kg dw）

（三）多元统计分析

1.层次聚类分析。对17个大蒜地理标志产品的29种品质成分进行层次聚类分析，结果如图2所示。从图2中可以看出，不同品种和地区的大蒜间的品质成分存在明显的差异。云南的大理独头大蒜（DLBZ014）、江西的临湖大蒜（DLBZ006）和河南的杞县大蒜（DLBZ012）相较于其他大蒜产品，品质成分含量较低。从不同大蒜地理标志产品来看，17个大蒜产品共被分为3个大组，兴平大蒜 （DLBZ015）为第1组，宝坻 大 蒜（DLBZ 001）、长 凝 大 蒜 （DLBZ002）、安 丘 两 河 大 蒜（DLBZ008）、苍山大蒜（DLBZ009）、嘉祥红皮大蒜（DLBZ010）、金乡大蒜（DLBZ011）、临颍大蒜（DLBZ013）、昭苏大蒜（DLBZ016）被聚为一组（第2组），其他大蒜产品被聚为第3组。被分为3组的大蒜在不同化合物含量上有着相当大的区别，第2组大蒜中的SAC、SMC、SPC、GABA、丝氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸含量高于其他两组大蒜产品；第1组和第2组大蒜中的亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸含量整体比第3组大蒜产品高；而GSAC、GSMC、蒜氨酸、大蒜素、精氨酸、谷氨酸等成分在第1组大蒜产品中含量更高，在第2组大蒜产品中次之。该结果表明，山东大蒜等第2组大蒜产品更适合用于加工富含GABA成分的产品，陕西大蒜更适用于大蒜素和γ－L－谷氨酰－S－烯丙（甲）基－L－半胱氨酸等特征成分的开发和利用，与上文分析结果相似。

图2 17个大蒜地理标志产品中29种特征性成分的层次聚类热图

值得注意的是，山东地区的安丘两河大蒜（DLBZ008）、苍山大蒜（DLBZ009）、嘉祥红皮大蒜（DLBZ010）被聚类为一小组，而金乡大蒜（DLBZ011）却被聚类到另一小组。该结果表明，除地理位置对大蒜的品质成分含量有影响外，品种对大蒜品质成分含量也有较大影响。

2.主成分分析。主成分分析是能够保持最大方差的情况下实现数据降维的一种非监督模式的算法，将复杂的多变量数据转换为少量的新变量。17个大蒜地理标志产品中29种品质成分的PCA分析得分图和载荷图分别如图3A和图3B所示。从PCA得分图可以看出，不同的大蒜样品可以被区分开，且得分图的样品分布与图2层次聚类热图中的聚类分组相似；山东和河南的大蒜品质成分含量差异较小，猜测可能是因为山东和河南地理位置相邻，气候和环境相似度比较高。从载荷图可以看出，各化合物都分布在距离载荷图中心原点较远的位置，对PCA模型的贡献都较大，说明不同大蒜样品中品质成分含量均有较大差别，进一步验证了产地和品种对大蒜品质的影响。

图3 17个大蒜地理标志产品中29种品质成分的PCA分析得分图（A）和载荷图（B）

3.正交偏最小二乘判别分析。将17个地理标志产品根据大蒜鳞茎的外皮颜色分为紫皮大蒜（ZP）和白皮大蒜（BP）两组，进行OPLS－DA分析，结果如图4所示。从得分图可以看出，不同外皮颜色的大蒜之间品质成分有差异。筛选变量投影重要度（VIP）值＞1、P值＜0.05和倍数变化（FC）值＞1的差异化合物，结果见表3。紫皮大蒜和白皮大蒜之间脯氨酸、甲基蒜氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、谷氨酸等化合物的差异较大。其中，谷氨酸在紫皮大蒜中的含量更高，其他化合物在白皮大蒜中含量更高。这与ALFREDO等[13]得出的西班牙本地紫皮大蒜中甲基蒜氨酸含量相比白皮大蒜中含量更高的研究结论不一致，可能是由于品种、地理位置、土壤条件等因素不同，而产生不同结论[14]。

表3 紫皮大蒜和白皮大蒜之间的差异化合物

图4 紫皮大蒜和白皮大蒜OPLS-DA分析得分图

三、结论

本文对我国17个不同产地和不同品种的大蒜地理标志产品中的29种品质成分进行分析，结果发现，我国大蒜地理标志产品品质成分含量水平整体较高，含有较高水平的蒜氨酸、大蒜素、甲基蒜氨酸等含硫化合物，同时游离氨基酸含量丰富，是氨基酸的优良来源。尤其山东和陕西地区大蒜中含硫化合物含量整体较高，适合用于提取和加工大蒜素、大蒜精油等含硫化合物相关产品。同时，山东地区的苍山大蒜和金乡大蒜适合用于生产富含GABA成分的深加工产品，陕西兴平大蒜适合用于氨基酸类产品（除GABA外）的加工和研发。通过多元统计分析发现，不同地区和不同品种的大蒜地理标志产品的品质成分存在显著差异，不同外皮颜色的大蒜之间品质成分也有显著差异，其中谷氨酸在紫皮大蒜中的含量更高，脯氨酸、甲基蒜氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸在白皮大蒜中含量更高。本文工作仅是针对同一年份采集的大蒜地理标志产品的品质成分差异进行研究初探，所得结果受当年各地光照、降水、土壤肥力等因素影响较大，因此，为深入探究我国大蒜地理标志产品的品质差异，还需持续开展品质监测，综合多年数据明确我国各大蒜地理标志产品的品质特色。