不同成熟期鲜食水稻中蛋白质的营养消化特性研究

宋雪健， 王欣卉， 李 丹，2， 李志江， 周 义, 张爱武, 张东杰

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319) (粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心2，大庆 163319)

人们对“亮度、精度、白度”的追求使谷物存在过度加工现象，导致营养及功能性成分损失，因此，包含了麸皮、胚芽及胚乳等未研磨、粉碎的鲜食全谷物食品研究成为热点。目前对于鲜食玉米[1]、鲜食大豆的研究较为广泛。Kim等[2]研究了紫糯玉米籽粒灌浆期花色素苷和氨基酸含量及脂肪酸组成，发现籽粒灌浆过程中，随着籽粒颜色变暗，花青素含量增加。Muller等[3]对新鲜大豆中的呋喃脂肪酸进行研究发现，3种呋喃脂肪酸在试样新鲜大豆中都被定量鉴定。水稻的成熟过程包括乳熟期(前期、中期、后期)、蜡熟期、完熟期5个过程。取食鲜嫩的籽粒或者乳熟期的新鲜果穗的水稻被称为鲜食水稻。Jiamyangyuen等[4]对来自泰国的2种白米、黑米及红米共计4种稻米，在水稻成熟过程中经历的5个时期的原花色素、花青素、总酚及总黄酮等指标进行研究，结果发现抗氧化活性与生物活性成分高度相关。李洪亮等[5]对不同时期的鲜食水稻研究发现，在乳熟后期时多糖对ABTS+·的清除率为86.18%、羟基自由基的清除率为75.62%，均高于其他时期。曲鹏宇等[6]研究发现在水稻成熟过程中水溶性膳食纤维含量逐渐变低，乳熟中期水稻茎中的水溶性膳食纤维质量分数最高为3.40%，成熟期籽粒最低为0.50%。水稻中蛋白质的含量是评价其品质的重要指标之一[7]，鲜食水稻还处于成熟阶段，具有较高生物活性的小分子蛋白质含量较高，因此，对鲜食水稻蛋白质的研究是非常有必要。

蛋白质需要通过肠胃中的酶消化后，分解成小肽的形式才能被体内消化吸收。体内评价方法虽然有着更高的准确性，能反应食物在体内的具体变化情况，但其方法有着实验周期长，经费高，结果重现性差、受个体差异影响大等问题[8]。体外模拟消化具有操作简单、廉价、实验周期短、可重复性高等特点[9]，常被应用在食物蛋白质的消化机理研究中，其模式可分为体外模拟胃、肠道、总消化3种[10]。王章存等[11]表明高压预处理大米蛋白有利于酶解产生更高抗氧化活性的大米肽。佟立涛等[12]研究发现，通过体外消化后的大米蛋白具有较好的生物活性，如抗氧化活性高，并通过对蛋白质酰化、微波及两者结合的方法可以提高蛋白质的消化率。通过前期研究工作发现，乳熟期的鲜食水稻中蛋白质由分子质量为10～25 ku小分子组成，完熟期蛋白质由分子质量为10～25、55、70、100 ku蛋白分子组成，随着水稻的逐渐成熟，鲜食水稻中的蛋白质分子逐渐增大。在前期工作的基础上，本研究以鲜食水稻为研究对象，对其在5个不同成熟时期的蛋白质的抗氧化活性及氨基酸组成、评分、体外模拟消化等营养进行研究，为今后对鲜食水稻整体评价及应用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要试剂

水稻样品均采自黑龙江省鹤岗市宝泉岭名山农场。选择黑龙江省种植较为广泛的水稻品种龙粳31号在不同的成熟期(乳熟前期、乳熟中期、乳熟后期、蜡熟期、完熟期)作为实验的材料。采收后样品均置于-20 ℃冷库冷藏保存，全部采收结束后由冷链车运输至实验室冷库中储藏12 h。羟自由基测试试剂盒BR级；总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(ABTS+·法)微板法BR级；抑制与产生超氧阴离子自由基测试试剂盒(比色法)BR级；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)AR级；维生素C标准品AR级；1∶3 000胃蛋白酶；1∶250胰蛋白酶；磺基水杨酸AR。

1.2 实验设备

TU-1810型紫外可见分光光度计，HWS24型电热恒温水浴锅，YB-1000A型高速多功能粉碎机，Beta2-8LD plus型冷冻干燥机，THU35C型SATAKE实验砻谷机。

1.3 实验样品前处理及蛋白质提取

实验对筛选出颗粒饱满，无霉斑、虫害的稻谷进行砻谷，磨粉过80目筛，并用石油醚脱脂：取稻米粉适量，在室温下按液料比3∶1 mL/g加入石油醚，搅拌脱脂5 h，静止1 h后分层，去除上层的石油醚，将下层的沉淀成分，置于通风橱中直至石油醚挥发完，进而得到了全脱脂的鲜食水稻粉。

向鲜食水稻粉中加入一定量的蒸馏水，用1 mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5，在特定的温度下进行搅拌浸提后，在3 200 r/min的条件下离心20 min，取出上层清液，用1 mol/L的HCl溶液调节pH至4.5，继续在3 200 r/min的条件下离心20 min后，对沉淀物质进行水洗得到沉淀物质，重复3次以上操作，冷冻干燥，即得到鲜食水稻蛋白质。

1.4 蛋白质含量测定

根据凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.5 氨基酸组分分析

氨基酸测定条件：缓冲液流量20 mL/h，茚三酮流量10 mL/h，柱温58 ℃和135 ℃，色谱柱20 cm，分析时间32 min ,标准峰保留时间为20 min左右，具体方法参考[13]。

1.6 鲜食水稻成熟过程中蛋白质抗氧化活性的变化

1.6.1 ABTS+·自由基清除能力的测定

按照总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(ABTS+·法)微板法说明书进行操作，测定抗氧化能力。取2支试管(A为测试管和B为对照管)并分别加入1 mL的试剂1，在A中加入0.2 mL的鲜食水稻待测样，分别向A、B试管中加入2 mL试剂2和0.5 mL试剂3，混匀后置于37 ℃的水浴中30 min，向A、B试管中加入0.2 mL试剂4，向B管中0.2 mL的鲜食水稻待测样，再向A、B试管中各加入0.2 mL试剂5，混匀，静置10 min后用蒸馏水进行调零，在520 nm波长处测定样品的光密度值[14]。

T-AOC=

(1)

1.6.2 DPPH·清除率的测定

参照Phongthai等[15]的方法对DPPH自由基清除能力进行测试，0.2 mg/L的DPPH溶液现配现用，并在517 nm波长处测定吸光度，按式(2)计算DPPH·清除率。

(2)

1.6.3 对·OH清除率的测定

参照Li等[16]的方法对·OH清除率进行测定，在37 ℃水浴条件下反应30 min，在536 nm波长处测定吸光度。

(3)

1.6.4 超氧阴离子自由基清除率测定

在37 ℃的水浴条件下，将含有4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl(pH值为8.2)缓冲液的试管恒温30 min后，分别加入0.5 mL 25 mmol/L邻苯三酚，选用蒸馏水来代替本底管，在37 ℃水浴条件下向样品管和本底管中加入不同体积样品，混匀，充分反应5 min，再用1 mL 0.2 mol/L HCl溶液来终止反应，测定在420 nm波长下的吸光度。

(4)

1.7 鲜食水稻蛋白质成熟过程中蛋白质的营养消化

1.7.1 氨基酸评分

将已知的必需氨基酸含量换算为每个蛋白质中所含氨基酸含量后，与1973年FAO/WHO建议的每个氮氨基酸评分标准模式[17]和中国预防医学院提出的鸡蛋蛋白质评分标准进行比较分析[18]，按式(5)～式(7)计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)和必需氨基酸指数(EAAI)。

AAS=

(5)

CS=

(6)

(7)

式中：aa1，aa2，aa3，…，aai分别表示蛋白质中的必需氨基酸的比率(A/E)；AA1,AA2,AA3，…，AAi：分别表示整个鸡蛋中蛋白质的必需氨基酸比率；n表示必需氨基酸的个数，实验中为7。

1.7.2 体外模拟胃消化

参照吴伟等[19]的方法进行体外模拟胃消化实验，在37 ℃的条件下取质量分数为1%的蛋白溶液(用蒸馏水配制，下同)预热10 min后，1 mol/L HCl调pH为3，每100 mL溶液中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为3×106U，下同)，在37 ℃的条件下振荡消化水解1.5 h，用1 mol/L NaOH调节pH为7，进行灭酶处理，即可测得蛋白质的胃消化率。

1.7.3 体外模拟肠消化

参照任大喜等[20]研究进行体外模拟肠消化实验，将浓度为1%的蛋白溶液置于37 ℃的水浴条件下，预热10 min，用1 mol/L NaOH调pH为7，在每100 mL溶液中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为1.25×105U，下同)，在37 ℃的条件下振荡消化水解2 h后，沸水浴下灭活5 min，即可测得蛋白质的肠消化率。

1.7.4 体外模拟总消化

参照Zhu等[21]的研究对体外模拟总消化进行测试，将质量分数为1%的蛋白溶液置于37 ℃的水浴条件下，预热10 min，用1 mol/L HCl调pH为2，在37 ℃的恒温摇床条件下，先加入胃蛋白酶进行消化水解1.5 h，用l mol/L NaOH调 pH为7，再加入胰蛋白酶进行消化水解2 h，然后用沸水浴进行灭活5 min，测得蛋白质的总消化率。

(8)

式中：m1为样品蛋白质量/g；m0为消化后滤渣蛋白质量/g。

1.8 数据统计与分析

每组实验重复3次，实验所得数据使用SPSS 20版进行方差分析及邓肯多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同成熟期鲜食水稻的蛋白质含量

不同成熟期鲜食水稻中蛋白质含量如表1所示。随着灌浆的进行，蛋白质含量在乳熟期存在显著性差异，蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生物生长过程中的基础营养素，乳熟前期蛋白质含量最高[22]，说明此时期的鲜食水稻处于生长的旺盛期。

表1 鲜食水稻成熟过程中蛋白质的含量 (g/100 g DW)

2.2 鲜食水稻成熟过程中蛋白质的抗氧化活性

2.2.1 ABTS+·清除能力

图1 不同浓度下鲜食水稻蛋白质的ABTS+·清除能力

谷物蛋白质具有较好的抗氧化能力，机体的抗氧化能力强弱与健康程度存在着密切的联系[23]。由图1可知，随着质量浓度的升高，VC与5个时期鲜食水稻蛋白质的总抗氧化能力均逐渐增强，VC与5个时期的鲜食水稻蛋白质的总抗氧化能力存在显著性差异(P<0.05)，在1 000 μg/mL时，乳熟前期到完熟期总抗氧化能力为228.38、120.03、117.71、115.18、109.11 U/mg，每个时期间抗氧化活力变化趋势不大。乳熟期的鲜食水稻蛋白质总抗氧化能力显著高于完熟期是因为乳熟期的水稻还处于生长期，小分子蛋白含量要高于完熟期，而小分子蛋白质的总抗氧化活力高于大分子蛋白质，因此总抗氧化能力要高于完熟期。

2.2.2 DPPH·清除能力

稳定的DPPH基团在乙醇中显示，在517 nm处吸光值为最大。当DPPH遇到含氢物质时，自由基将被清除，颜色从紫色变为黄色，并且吸光度降低[24]。可以得出，鲜食水稻蛋白质含有作为电子供体的氨基酸或肽，并且可以与自由基反应以将它们转化为更稳定的产物并终止自由基链式反应。由图2可知，VC与5个成熟期鲜食水稻蛋白质都具有一定的DPPH·清除能力，VC随着浓度的增加，其DPPH·清除能力基本保持不变；5个不同成熟时期鲜食水稻蛋白质随着样品浓度的增加，DPPH·清除能力液随之增加。VC与5个时期的鲜食水稻蛋白质的DPPH·清除能力存在显著性差异(P<0.05)。在相同质量浓度下5种不同时鲜食水稻蛋白质DPPH·清除能力顺序为：VC>乳熟前期>乳熟中期>乳熟后期>蜡熟期>完熟期(P<0.05)。

图2 不同浓度下鲜食水稻蛋白质的DPPH自由基清除率

2.2.3 ·OH清除能力

·OH基清除率是反应物质抗氧化活性的重要指标之一，Fenton反应体系是人体内产生·OH的重要途径；·OH具有非常强的夺电子能力，是体内最活泼的活性氧，会造成很多病理性变化；因此，去除·OH可能是抵御许多疾病的有效方法[25]。由图3可以看出，VC与鲜食水稻蛋白质都具有一定的·OH清除能力。VC与5个时期的鲜食水稻蛋白质的·OH基清除率存在显著性差异(P<0.05)，VC质量浓度在100～600 μg/mL时，清除能力基本保持不变；而5个不同时期鲜食水稻蛋白质随着质量浓度的增加，其·OH清除能力逐渐增加。在相同质量浓度下，VC清除·OH能力均高于不同时期鲜食水稻蛋白质。

图3 不同浓度下鲜食水稻蛋白质的·OH清除率

2.2.4 超氧阴离子自由基清除能力

由图4可知，随着质量浓度的增加，VC与不同时期鲜食水稻蛋白都具有一定的超氧阴离子自由基的清除能力。随着质量浓度的增加，VC与不同时期鲜食水稻蛋白质清除超氧阴离子自由基的能力逐渐增强。VC与5个时期的鲜食水稻蛋白质的超氧阴离子自由基的清除能力存在显著性差异(P<0.05)，在1 000 μg/mL时，乳熟前期到完熟期抗超氧阴离子清除率分别为48.89%、47.95%、45.96%、38.35%、37.73%，可以看出在相同浓度下乳熟前期鲜食水稻蛋白质的抗超氧阴离子清除能力要高于完熟期，但均低于VC。

图4 不同浓度下鲜食水稻蛋白质的超氧阴离子自由基清除率

2.3 鲜食水稻蛋白质成熟过程中蛋白质的营养消化

2.3.1 鲜食水稻蛋白氨基酸分类所占比例

由表2可知，5个不同时期的鲜食水稻中，乳熟前期TAA、EAA、HAA、BAA、DAA含量最高，分别为9.75、3.60、3.89、1.46、7.70 g/100 g，5个不同时期鲜食水稻的必需氨基酸含量分别占氨基酸总量较高的时期是乳熟中期；5个不同时期鲜食水稻的半必需氨基酸含量分别占氨基酸总量的17.53%、17.63%、17.65%、17.43%、17.68%；蛋白质的营养价值是由所含氨基酸的种类、比例和数量所决定，其中必需氨基酸含量和所占比例是决定蛋白质营养价值的主要因素。本实验中，乳熟中期鲜食水稻的必需氨基酸占总氨基酸质量分数最高达到37.46%，EAA/NEAA(E/N)为0.599且与FAO/WHO提出的EAA/TAA约为40.00%接近[26]，高于完熟期的鲜食水稻，表明乳熟中期鲜食水稻中的蛋白质是一种品质良好的蛋白质。

表2 5个时期鲜食水稻蛋白质中氨基酸分类及所占比例/g/100 g

EAAI、AAS、CS是比较分析动物体必需氨基酸组成、衡量蛋白质营养价值的常用指标[27]。由表3可知，乳熟中期鲜食水稻的EAAI最高为84.79，其余5个时期依次为：82.92、84.04、84.02、83.25。根据AAS和CS评分可知，鲜食水稻中第一限制氨基酸为赖氨酸。EAAI可判定蛋白源对人体的营养价值，AAS为蛋白质中某一必需氨基酸占FAO/WHO模式中相应氨基酸含量的百分比，CS用来评价蛋白源中某一必需氨基酸的含量与标准鸡蛋蛋白中相对应的必需氨基酸含量的接近程度[28]。本实验证明鲜食水稻中氨基酸种类齐全，且乳熟中期的氨基酸营养价值高于完熟期的鲜食水稻。

2.3.2 体外模拟胃消化

消化率是机体消化吸收的食物量占食物总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标之一。实验以鲜食水稻蛋白质为实验样品，采用胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟人体胃肠道环境，对5个不同成熟时期的鲜食水稻蛋白质进行体外模拟胃、肠消化实验，评价鲜食水稻蛋白质体外胃消化率、肠消化率以及总消化率。由图5可知，在鲜食水稻成熟过程中，鲜食水稻蛋白质的体外模拟胃消化是呈现逐渐减低的趋势。乳熟期前、中、后3个时期的鲜食水稻蛋白质体外模拟胃消化的变化不显著(P>0.05)，而乳熟期与蜡熟期之间存在显著性(P<0.05)变化，说明乳熟期鲜食水稻蛋白质在体外模拟胃消化率高于蜡熟期与完熟期的鲜食水稻蛋白质。但5个时期的鲜食水稻蛋白质在体外模拟胃消化环境下消化率均不高，均在40%以下，说明人体摄入的食物蛋白只有少部分在胃内进行消化，大部分的蛋白质在肠道中进行消化。

表3 不同时期鲜食水稻蛋白质必需氨基酸组成的评价/(mg/gN)

2.3.3 体外模拟肠道消化

由图5可知，在鲜食水稻成熟过程中，鲜食水稻蛋白质的体外模拟肠道消化是呈现逐渐减低的趋势。乳熟前期与中期鲜食水稻蛋白质的体外模拟肠道消化率不存在显著性差异(P>0.05)，但显著高于蜡熟期与完熟期的鲜食水稻(P<0.05)，表明乳熟前期与中期的鲜食水稻蛋白质更易于人体吸收和利用。5种不同时期鲜食水稻蛋白质的体外模拟肠道消化率均接近于50%，尤其是乳熟前期的鲜食水稻蛋白质体外模拟肠道消化率48.46%，进一步说明人体摄入的食物蛋白质主要在肠道中进行吸收利用，这与Hamosh[29]的研究一致。

2.3.4 体外模拟总消化

由图5可知，在鲜食水稻成熟过程中，鲜食水稻蛋白质的体外模拟胃消化是呈现逐渐减低的趋势。乳熟期前、中、后3个时期的鲜食水稻蛋白质体外模拟胃肠总消化的变化不显著(P>0.05)，均接近于75%，但显著高于蜡熟期和完熟期鲜食水稻蛋白质的消化率，表明乳熟期的鲜食水稻蛋白质更能得到机体的吸收与利用，所以从蛋白质消化吸收角度来看，乳熟期的鲜食水稻营养价值更高。

注：同一消化阶段标注字母相同表示无显著性差异，字母不同表示有显著性差异。图5 不同时期鲜食水稻蛋白质体外模拟消化

3 结论

本研究以5个不同成熟时期鲜食水稻为实验样品，对各时期鲜食水稻中的蛋白质进行提取，并对抗氧化活性以及蛋白质功能特性进行研究发现，乳熟期的鲜食水稻蛋白质总抗氧化能力、DPPH·清除能力、·OH清除能力、超氧阴离子自由基清除能力均高于完熟期的鲜食水稻蛋白质，但均低于VC。稻米中氨基酸种类齐全，乳熟中期鲜食水稻的EAAI最高为84.79，鲜食水稻中第一限制氨基酸为赖氨酸，乳熟中期的氨基酸营养价值高于完熟期的鲜食水稻；乳熟期前、中、后3个时期的鲜食水稻蛋白质体外模拟胃、肠、总消化的变化不显著(P>0.05)，总模拟消化接近于80%，显著高于蜡熟期和完熟期鲜食水稻蛋白质的消化率，表明乳熟期的鲜食水稻蛋白质更能得到机体的吸收与利用，所以从蛋白质消化吸收角度来看，乳熟期的鲜食水稻营养价值更高。