基于高通量测序技术对红星大曲中微生物多样性的相关研究

杜艳红，谭 昊，聂建光，李洪媛，王小伟，陈思佳，李 晓，李婷婷

（北京红星股份有限公司，北京 101400）

酒曲酿酒，是中国劳动人民长期经验的积累和智慧的结晶，酒曲的重要性可与我国四大发明媲美。酒曲是酿造传统白酒重要的原料之一，素有“曲为酒之骨”之美誉。白酒品质的好坏与酒曲是密不可分的。酒曲是以粮谷为主要原料，自然接种、开放式培养而成的物系、酶系、菌系三者共存的糖化发酵剂。白酒发酵实质上是由多种微生物协同作用的结果，酒曲是白酒发酵中微生物主要的来源。

近年来，随着现代分子生物学技术的发展，国内外有许多关于酒曲微生物多样性的研究。高通量测序技术能更为准确系统地对微生物的组成进行分析，进而更为客观、全面的分析微生物的群落结构。高通量测序技术目前已被广泛应用于分析白酒等发酵食品的微生物群落组成。乔晓梅等采用高通量测序技术对冷季和热季清香大曲真菌群落进行分析，明晰了清香大曲主要真菌群落为米根霉、伞支犁头霉、扣囊酵母、毕赤酵母，并解析了冷热季真菌组成差异；薛宇昂等采用高通量测序技术对石花酒大曲中微生物多样性进行解析，确定了细菌优势菌属为假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌属等，优势真菌为复膜孢酵母属、红曲菌属、热子囊菌属等，验证了细菌与真菌有一定的相关性；王勇等从牛栏山大曲中共获得358 种原核生物OTU和69 种真核生物OTU，确证乳酸菌类群是大曲中优势原核生物，扣囊酵母和毕赤酵母为优势真核生物。

以上研究成果为大曲中优势微生物开发及进一步深入的研究奠定了良好的基础。红星大曲中微生物丰富，种类繁多，群落结构复杂，有关红星大曲微生物多样性的研究相对较少。本研究以红星大曲为研究对象，采用Illumina MiSeq 高通量测序技术对红心、后火、清茬及强化大曲微生物多样性进行测序，分析微生物群落结构及其多样性，寻找各类型曲的主要差异，以期为红星大曲微生物资源开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 样品

红星大曲：采集自北京红星股份有限公司，四类样品分别命名为HQ（清茬曲）、HX（红心曲）、HH（后火曲）、HJ（强化高温曲）。

1.1.2 主要试剂与仪器设备

DNA 提取试剂盒E.Z.N.A.Soil DNA Kit，美国Omega Biotek 公 司；TransStart Fastpfu DNA Polymerase（TransGen AP221-02），北京全式金生物公司；AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒，AXYGEN 公司；GeneAmp®9700 型PCR 仪，美国ABI 公司；Quanti-Fluor™-ST 蓝色荧光定量系统，Promega 公司；Illumina Miseq 高通量测序平台，美国Illumina公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

将采集到的红星大曲样品粉碎后备用。

1.2.2 DNA抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A.® soil DNA kit 说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取质量，使用NanoDrop2000 测定DNA浓度和纯度。PCR反应参数：预变性3 min(95 ℃)，变 性30 s (95 ℃)，退 火30 s (55 ℃)，延 伸45 s(72 ℃)，终延伸10 min(72 ℃)，细菌循环数为27，真菌为35。第二轮PCR 扩增：以第一轮PCR 扩增产物为模板进行扩增，扩增体系同“第一轮扩增”。使用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物对细菌16S rRNA 基因V3—V4 可变区进行PCR 扩增；使用ITS1F(55'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2R(55'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')引物对真菌的内部转录间隔区（ITS1）进行PCR扩增。

1.2.3 Illumina Miseq测序

将同一样本的PCR 产物混合后使用2 %琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA) 进行回收产物纯化，2 %琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™Fluorometer(Promega,USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美国）进行建库：(1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR 扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收PCR 产物得到最终的文库。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.2.4 数据处理

使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）软件进行拼接：

（1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp 的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp 以下的reads，去除含N碱基的reads；

（2）根据PE reads 之间的overlap 关系，将成对reads 拼接(merge)成一条序列，最小overlap 长度为10 bp；

（3）拼接序列的overlap 区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；

（4）根据序列首尾两端的barcode 和引物区分样品，调整序列方向，barcode 允许的错配数为0，最大引物错配数为2。

使用UPARSE软件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根据97 %的相似度对序列进行OTU 聚类并剔除嵌合体；利用RDP classifier(http:// rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对数据库；并利用上海美吉生物医药科技有限公司的I-sanger 云数据分析平台进行在线数据分析。

2 结果与分析

2.1 群落丰度和多样性分析

2.1.1 稀释曲线分析

Shannon 指数曲线反映样本中微生物的多样性，利用各样本测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。

如图1、图2 所示，随着测序量的增加，物种的数量增加，Shannon曲线进入了平缓期，表明物种数量已经达到饱和，即便有新物种的产生，多样性也不会随着测序量的增加而发生变化。说明测序数据量已足够大，可以反映样品中绝大多数生物的物种信息。

图1 真菌Shannon曲线

图2 细菌Shannon曲线

2.1.2 真菌及细菌多样性指数分析

使用Illumian MiSeq 高通量测序技术对4 个红星大曲的真菌及细菌多样性进行分析，ITS1测序结果及多样性指数见表1，16S rRNA 测序结果及多样性指数见表2。ACE 和Chao 指数是估算样品中物种数目及所含OTU 数目的指数，反映样品的物种丰度；Shannon 指数和Simpson 指数用来表现样品中物种的均匀度和丰富度，指数的高低会受均匀度影响，样本中的物种分布越均匀，多样性越高；Coverage反映样本的测序饱和度。

表1 红星大曲真菌多样性指数对比

表2 红星大曲细菌多样性指数对比

由表1 可知，4 个红星大曲样品中共检出224050条真菌序列，样品高温强化曲中真菌群落丰度最高，其次是红心曲、清茬曲，后火曲群落丰度最低；样品高温强化曲多样性最高，其次是后火曲、红心曲，清茬曲多样性最低。由表2 可知，4 个红星大曲样品中共检出160589 条细菌序列，清茬曲中细菌群落丰度最高，其次是后火曲、红心曲，高温强化曲细菌群落丰度最低；样品清茬曲细菌多样性最高，其次是后火曲、红心曲，高温强化曲细菌群落多样性最低。

2.1.3 Venn图分析

Venn 图可以统计多种样品中独有和共有的OTU 数，可直观地显示样品OTU 数组成的相似性及重叠等情况，对于不同样品之间独有和共有的OTU数叠加，可得出OTU分布Venn图。

由图3 可知，4 个红星大曲样品中总共有真菌OTU 数目是151，样品高温强化曲中独有的真菌OTU 数目是54，是4 个样本中独有数目最多的样本，凸显了该样本微生物菌群的复杂性和特殊性。由图4 可知，4 个红星大曲样品总共有细菌OTU 数目是471，样品清茬曲中独有的细菌OTU 数目是318，是4 个样本中独有数目最多的，凸显了该样本微生物菌群的复杂性和特殊性，样品高温强化曲的细菌独有OTU 数目是32，凸显了该样本微生物菌群的特殊性。

图3 真菌VENN图分析

图4 细菌VENN图分析

2.2 基于属水平的结构分析

由图5 可知，4 个样品中共有优势真菌属为复膜孢酵母属（）、嗜热子囊菌属（）、威克汉姆酵母属（）、曲霉属（）和丝孢毕赤酵母属（），平均相对含量分别为75.24 %、10.75%、4.91%、2.25%、1.78%和1.22%。

图5 HH&HJ&HX&HQ共有真菌物种饼状图（属水平）

由图6 可知，清茬曲中主要优势真菌为复膜孢酵母属，相对含量高达97.93 %，为绝对优势微生物。在红心曲中优势真菌包括复膜孢酵母属、嗜热子囊菌、单端孢属（）、曲霉属，相对含量分别为：89.92 %、3.10 %、4.05 %、0.75 %。后火曲中优势真菌为复膜孢酵母、嗜热子囊菌属、曲霉属，相对含量分别为：85.31 %、7.19 %、7.12 %。高温强化曲优势真菌为复膜孢酵母属、嗜热子囊菌属、威克汉姆酵母属、丝孢毕赤酵母属、曲霉属，相对含量分别为：27.91%、32.74%、18.16%、4.08%、1.14%。综上，红星4 种大曲样品中优势真菌存在明显差异。

图6 样品中真菌组成图（属水平）

由图7 可知，4 个样品中优势细菌属为克罗彭斯特菌属（）、链霉菌属（）、芽孢杆菌属（）、葡萄球菌属（）、乳杆菌属（）、枝芽孢菌属()、泛生菌属（）、海洋芽孢杆菌属（）和魏斯氏菌属（），平均相对含量分别为34.16 %、21.52 %、13.06 %、5.02%、4.62%、4.06%、3.87%、3.50%和2.84%。

图7 HH&HJ&HX&HQ共有细菌物种饼状图（属水平）

由图8 可知，清茬曲中优势细菌为链霉菌属、克罗彭斯特菌属、葡萄球菌属、泛生菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属，相对含量分别为：22.76 %、19.43%、12.12%、10.69%、8.29%、7.17%。红心曲中优势细菌为链霉菌属、克罗彭斯特菌属、葡萄球菌属、海洋芽孢杆菌属、乳杆菌属、塔式糖多孢菌属（）、泛生菌属，相对含量分别为62.46 %、9.64 %、6.65 %、5.51 %、3.44 %、3.20 %、3.08%。后火曲中主要优势细菌为芽孢杆菌属、克罗彭斯特放线菌属、塔式糖多孢菌属、海洋芽孢杆菌属、高温放线菌属，相对含量分别为42.0 %、29.12 %、13.72 %、9.99 %、1.09 %。高温强化曲主要优势细菌为克罗彭斯特菌属、枝芽孢菌属、魏斯氏菌属、乳杆菌属，相对含量分别为78.44 %、10.55%、6.72%、2.99%。综上，红星大曲样品中优势细菌存在明显差异。

图8 样品中细菌组成图（属水平）

2.3 样品中真菌及细菌相似性分析

通过非度量多维尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析群落间存在的关系，根据样品中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上，对不同样品间的差异程度，则是最终通过点与点的距离表现在图中，距离远近代表样品中菌体群落的差异程度。

由图9 可知，清茬曲、红心曲和后火曲距离较近，聚集在图的左侧，群落差异较小；高温强化曲的细菌微生物聚集在右侧部分，距清茬曲、红心曲和后火曲差异较大，构成一个独立的组群。由图10可知，层级聚类树与NMDS 相似，4 种大曲共聚为两大支，清茬曲、红心曲和后火曲的真菌属聚为一类，差异较小，其中红心曲和后火曲真菌组成最为接近，高温强化曲的真菌属另聚为一类。

图9 真菌非度量多维尺度分析（NMDS）

图10 真菌基于Beta多样性距离的样品层级聚类树

由图11 可知，清茬曲和红心曲距离较近，聚集在图的右侧，群落差异较小；高温强化曲和后火曲的细菌微生物聚集在左侧部分，距清茬曲和红心曲较远，差异较大，构成一个独立的组群。由图12 可知，层级聚类树与NMDS 相似，4 种大曲共聚为三类，清茬曲和红心曲细菌属聚为一类，差异较小，高温强化曲和后火曲的细菌分别为一类。

图11 细菌菌落非度量多维尺度分析（NMDS）

图12 细菌基于Beta多样性距离的样品层级聚类树

2.4 物种差异分析

Kruskal_Wallis 秩和检验，是一个将两个独立样本的wilcox 秩和检验推广到3 个或更多组检验的方法，是多组（≥3）独立样本非参数检验的一种方法。该分析可以对多组样本的物种进行显著性差异分析，纵轴表示某一分类水平下的物种名，物种对应的每个柱子表示该物种在各样本组中的平均相对丰度，不同颜色表示不同分组。最右边为P值，*0.01＜P≤0.05，**0.001＜P≤0.01，***P≤0.001，用于观测多物种在多组间的差异。

由图13 可以看出，清茬曲与其他大曲真菌组成有显著差异，优势真菌菌属为复膜孢酵母属和威克汉姆酵母属，复膜孢酵母菌数含量高于其他大曲。红心曲优势真菌菌属为：复膜孢酵母菌属、嗜热子囊菌属和单端孢菌属，其中单端孢菌属含量稍高于其他大曲。后火曲优势真菌菌属为：复膜孢酵母菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属，其中曲霉属含量高于其他样品。强化高温曲以复膜孢酵母菌属、嗜热子囊菌属、威克汉姆酵母属等为优势真菌，嗜热子囊菌属、威克汉姆酵母属物种含量高于其他大曲，物种多样性高，出现了德巴利酵母属（）、双足囊菌属（）等特有物种。

图13 真菌多物种差异检验柱形图

由图14 可以看出，清茬曲与其他大曲细菌组成显著差异，主要优势细菌菌属为：克罗彭斯特菌属、链霉菌属、芽孢菌属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属、范球菌属等，物种丰度和多样性最高。红心曲以克罗彭斯特菌属、链球菌属、葡萄球菌属、海洋芽孢杆菌属等为主要优势细菌菌属，其中链霉菌属含量远高于其他菌属。后火曲以克罗彭斯特菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、海洋芽孢杆菌属为主要优势细菌菌属，其中芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属含量高于其他样品。高温强化曲以克罗彭斯特菌属、塔式糖多孢菌属、魏斯氏菌属为主要优势细菌菌属，塔式糖多孢菌属、魏斯氏菌属含量远高于其他样品。

图14 细菌多物种差异检验柱形图

3 结论

本研究使用高通量测序技术，以真菌的内部转录间隔区（ITS1）和细菌16S rRNA 的V3—V4 为测序靶点，分析红星大曲中的真菌和细菌微生物多样性。结果发现，红星大曲中的真菌主要由膜孢酵母属（）、嗜热子囊菌属（）、威克汉姆酵母属（）、曲霉属（）和丝孢毕赤酵母属（）5个属组成；红星大曲中的细菌主要由克罗彭斯特菌属（）、链霉菌属（）、芽孢杆菌属（）、葡萄球菌属（）、乳杆菌属（）、枝芽孢菌属()、泛生菌属（）、海洋芽孢杆菌属（）和魏斯氏菌属（）9 个属组成。红星强化高温曲真菌菌落和细菌菌落与清茬曲、红心曲和后火曲存在显著差异。高温强化曲增加了真菌组成的多样性和丰度，除复膜孢酵母菌属外，嗜热子囊菌属、威克汉姆酵母属、丝孢酵母菌属含量大幅提升；细菌组成以克罗彭斯特菌属、塔式糖多孢菌属、魏斯氏菌属为主要优势细菌，塔式糖多孢菌属、魏斯氏菌属含量远高于其他样品。红心曲与后火曲的真菌菌落组成更为接近，清茬曲和红心曲的细菌菌落更为接近。红星强化高温曲的真菌菌落组成丰度及多样性增加对提升红星清香大曲酒体风味丰富度有正向贡献，有待进一步深入研究。本研究不仅为高通量测序技术在红星白酒研究中的应用积累数据，也为今后改善大曲质量及综合利用多种大曲微生物提供了理论研究指导。