高粱泡叶中异槲皮素TLC鉴别与HPLC含量测定研究

李旭东，吴静澜，张永萍,2,3，郭 兵，聂 倩，谢朝宇

1.贵州中医药大学药学院(贵州 贵阳 550025) 2.国家苗药工程技术研究中心(贵州 贵阳 550025) 3.贵州中药炮制与制剂工程技术研究中心(贵州 贵阳 550025)

高粱泡叶是蔷薇科植物高粱泡(RubuslambertianusSer)的干燥叶，药味甘、苦，性平，具有清热凉血、解毒消疮等功效，可用于治疗感冒发热、咳嗽、便血、崩漏、外伤出血、皮肤糜烂、黄水疮等[1]。通过抑菌试验研究发现[2]其对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等均有抑制作用。查阅相关文献，目前对高粱泡的研究相对较少，课题组前期借助UPLC-Q Exactive Focus-MS技术对高粱泡叶提取物中分析，发现高粱泡叶中含有黄酮类、酚酸类等多种化学成分。本研究以异槲皮素为研究对象，建立高粱泡叶中的异槲皮素的薄层色谱及含量测定方法。

异槲皮素(Isoquercitrin)，别名异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷，是槲皮素的糖苷衍生物的一种(化学结构式见图1)，相关研究表明[3]异槲皮素通过其抗氧化作用及抑制皮质激素的分泌达到抗抑郁的作用。除此之外，异槲皮苷还具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、神经保护等生物活性[4]。另有研究表明[5]异槲皮素还可以作为一种治疗由紫外照射引起的皮肤衰老，可应用于药品及化妆品中，安全无毒。异槲皮苷也能抑制缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达，而增加血管内皮生长因子(VEGF)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达。是一种潜在的治疗骨质疏松症的一种更安全的选择[6]。异槲皮苷对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤的保护作用,被认为是一种潜在的肝保护剂[7]。综上可知，异槲皮苷可以作为一种功能性食品，具有非常广泛的应用前景和药用价值，值得进一步的研究开发。

图1 异槲皮素化学结构式

1 材料

1.1仪器AG135电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HHD-4型数显恒温水浴锅(常州市化普达教学仪器有限公司)；SB-4200D型数控超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司)；GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；Shimadzu SIL-20A高效液相色谱仪(日本岛津)。

1.2药品与试剂异槲皮素对照品(批号:DSTDY000601，供含量测定用，乐美天医药德思特生物)；高粱泡叶样品采自贵州省贵阳市花溪区元芳村，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为蔷薇科植物高粱泡；乙醇(分析纯，批号：20200805，国药集团化学试剂有限公司)；甲酸(分析纯，批号：20200501，重庆川东化工有限公司)、乙酸乙酯(分析纯，批号：20211206，天津风船化学试剂科技有限公司)、甲醇(分析纯，批号：20191121，国药集团化学试剂有限公司)；三氯化铝(分析纯，批号：2019122068，天津市致远化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1薄层鉴别取高粱泡叶粉末3.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加入70%乙醇60 mL，然后超声提取(频率为80 Hz)30 min，滤过，挥干部分乙醇，定容至10 mL，冷藏3 h，过滤，加石油醚萃取3次，再加乙酸乙酯萃取3次，挥干乙酸乙酯层，加2 mL甲醇溶解，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，精密称定异槲皮素3.04 mg，加甲醇定容至10 mL，超声溶解即为对照品溶液。吸取供试品和对照品溶液5 μL，点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯∶甲酸∶水∶氨水(18∶2∶1∶0.5)为展开剂，喷洒3%三氯化铝乙醇溶液，在365 nm紫外灯下观察。在同一块聚酰胺薄膜上，供试品与对照品在相同位置上有同一颜色的斑点(见图2)。

注：1：高粱泡叶样品；2：异槲皮素对照品。图2 高粱泡叶的薄层鉴别色谱图

2.2含量测定色谱柱为Agilent SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相；以乙腈为流动相B,以水(含2%磷酸)为流动相A，梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2 min,10.0%～15.0% B;2～22 min,15.0%～19.5% B;22～26 min,19.5%～21.0% B;26～30 min,21.0%～20.0% B;30～35 min,20.0%～10.0% B;35～45 min,10.0% B。柱温30℃，检测波长360 nm；流速1.0 mL/min；进样体积10 μL，在此高效液相色谱条件下,异槲皮素与样品中其他组分色谱峰达基线分离，峰形良好(见图3)。

注：A：异槲皮素(对照品)；B：高粱泡叶药材(样品)。图3 高粱泡叶HPLC含量测定色谱图

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取异槲皮素对照品2.2 mg，加10 mL甲醇制成0.22 mg/ mL的溶液，作为对照品溶液备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取高粱泡叶粉末2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加入70%乙醇60 mL，然后超声提取(频率为80 Hz)30 min，滤过，挥干部分乙醇，定容至10 mL，冷藏3 h，过滤，加石油醚萃取3次，再加乙酸乙酯萃取3次，挥干乙酸乙酯层，加2 mL甲醇溶解，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 线性关系的考察 分别精密吸取上述异槲皮素对照品溶液2、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件进样测定，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归处理，得回归方程Y=417 640X-32 234(r=1)，表明异槲皮素在2～20 μL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.4 精密度试验 取“2.2.1”项下配制的异槲皮素对照品溶液，按2.2项下色谱条件，进样10 μL，连续进样6次，分别测定峰面积，计算RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取高粱泡叶药材样品6份，每份2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按以上色谱条件分别进样测定，计算异槲皮素含量的RSD为1.26%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 加样回收试验 取高粱泡叶药材样品9份，每份约2.0 g，精密称定，分别按质量分数的50%，100%，150%共3个水平加入异槲皮素对照品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件，进样测定，计算异槲皮素平均加样回收率分别为95%，99%，103%，RSD分别为1.0%，0.8%，0.6%，表明方法测定准确度较高，见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

2.2.7 稳定性试验 取高粱泡叶药材样品2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，计算异槲皮素的峰面积的RSD为1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3 讨论

3.1薄层色谱考察研究前选择了3种不同厂家的薄层硅胶G板与聚酰胺薄层板进行对比研究，结果表明3种不同厂家的硅胶G板出现分离度不好，拖尾现象，效果没有聚酰胺薄膜好，故选择聚酰胺薄层板进行实验，又选择3个不同的展开系统乙酸乙酯∶甲酸∶水(17∶1∶1)；乙酸乙酯∶甲酸∶水(17∶2∶1)；乙酸乙酯∶甲酸∶水∶氨水(18∶2∶1∶0.5)，按照拟定方法试验。结果发现，前两个展开系统斑点分离较差，拖尾严重，展开系统[乙酸乙酯∶甲酸∶水∶氨水(18∶2∶1∶0.5)]效果较好，薄层色谱图斑点清晰，显色明显，满足色谱条件的各项要求。在考察不同点样量对薄层色谱的影响时，分别点样1、3、4、5、7 μL于同一薄层板上，进行实验，结果点样1～7 μL斑点均清晰，表明点样量对薄层色谱的影响不大，故选择点样量为5 μL的中等点样量。最后，考察了不同温度下点样对薄层色谱的影响，分别在15℃、25℃、35℃条件下，按“2.1”项中拟定TLC进行展开。结果表明，该方法对不同温度的适用性均良好，分离度较好，专属性强，故薄层鉴别展开时不需要在特定的温度下进行。

3.2含量测定方法考察HPLC含量测定方法考察了不同的流动相系统，基于色谱图的峰型、拖尾情况及分离度为参考，最后得到的梯度洗脱系统为：以乙腈-2%磷酸水溶液洗脱梯度为：0～2 min,10%～15% B;2～22 min,15%～19.5% B;22～26 min,19.5%～21%B;26～30 min,21%～20%B;30～35 min,20%～10%B;35～45 min,10% B，异槲皮素峰对称性好，并与杂质峰达到了基线分离。

色谱柱温的选择分别设置柱温为25℃、30℃、40℃，比较其分离效果，结果表明，柱温为25℃和40℃时分离度不好，未达到实验要求结果，柱温为30℃时分离效果和色谱峰峰形较好，故选择30℃作为检测柱温。

色谱柱进样量的选择分别设置进样量为5、7、8、10、15 μL，比较其分离效果，结果表明进样量为10 μL时的分离效果和色谱峰峰形较好，故选择进样量为10 μL。