FOXP3与宫颈癌发病风险及预后生物信息学

石凤 王俊利 董明右 庞晓霞 李光景 韦莹慧

(右江民族医学院 1附属医院生殖医学中心，广西 百色 533000；2医学检验学院临床血液学与形态学教研室)

宫颈癌(CESC)包括宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌，主要为宫颈鳞状细胞癌，占70%以上〔1〕。人乳头瘤病毒(HPV)感染，性生活，卫生条件，遗传因素及基因突变等是促进CESC发生的危险因素，其中长期高危型HPV感染是引起CESC的主要发病机制。近年来，HPV疫苗的使用降低了CESC的发生率〔2〕。然而，由于其覆盖率及费用，相对于发达国家而言，中低收入国家的CESC患病率高达四倍〔3〕。世界卫生组织报道CESC的发病率和死亡率有下降趋势，但每年仍有750 000例新增病例数〔4〕。迄今为止，CESC仍是严重威胁女性身心健康的妇科肿瘤之一。

叉头/翼状螺旋转录家族因子(FOXP)3定位于X染色体Xp11.23，含有11个编码外显子，属于FOX家族蛋白，特征性地表达于调节性T细胞(Treg)，参与Treg细胞的增殖、分化和成熟，控制Treg细胞的基因表达和转录。FOXP3是一种多结构域蛋白，氨基酸端包含亮氨酸拉链、锌指蛋白和阻遏结构域，羧基端包含叉头DNA结合结构域，FOXP3与Treg细胞启动子区域结合调节Treg细胞的基因表达，影响其转录水平，对诱导和维持Treg细胞独特的免疫抑制特性至关重要〔5〕。近年来，越来越多的证据表明FOXP3在癌症中发挥重要作用〔6〕。本研究旨在通过生物信息学分析FOXP3在不同组织中的表达及与癌症的关系，探讨FOXP3表达水平对CESC患者总体生存率的影响。

1 材料与方法

1.1数据获取 从UCSC Xena官网(https://xena.ucsc.edu/)提取33个肿瘤的TCGA数据，包括经FPKM是经校正后的转录组数据信息；基因突变信息和生存信息。所有的研究数据来源于TCGA公共数据库，该数据库数据对外开放，因此，不需要相关医学伦理委员会批准。

1.2FOXP3与CESC临床特性的相关性 通过UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在线数据库分析FOXP3在正常组织和肿瘤组织中的表达情况，并比较分析FOXP3表达水平与癌症患者临床特征的相关性，包括分级、种族、体重、年龄和淋巴结转移。

1.3COX回归分析CESC患者生存分析 通过FOXP3表达水平中位值将CESC患者分为两组，分别为高表达FOXP3组和低表达FOXP3组。采用COX回归分析FOXP3基因表达水平与CESC患者总体生存率的关系。

1.4FOXP3与肿瘤免疫细胞的相关性 输入癌症的基因转录组数据，通过R3.6.0的“estimate”包对CESC转录组数据进行免疫细胞得分和基质细胞得分。进一步通过生物信息学分析在CESC中，FOXP3与免疫细胞的相关性，包括树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg的相关性。

1.5统计学处理 通过Perl软件对TCGA肿瘤转录组数据的基因编号转化为基因名字，对通过Wilcox秩和检验比较FOXP3在正常组和CESC组及临床特征的差异，通过Kaplan-Meier绘制FOXP3表达水平与CESC患者的生存曲线。通过Spearman检验分析FOXP3与免疫细胞浸润的相关性，本研究检验结果均通过R3.6.0程序计算所得。

2 结 果

2.1FOXP3在肿瘤组织中的表达 将下载的TCGA转录组数据，通过Perl命令提取所需要的输入文件，包括基因名称、FOXP3在肿瘤组织中的表达水平、组织类型和肿瘤类型。通过R3.6.0语言的“ggpubr”包对FOXP3在肿瘤组织和正常组织中的表达绘制箱线图，结果如图1所示，FOXP3在膀胱癌(BLCA)、乳腺浸润癌(BRCA)、CESC、结肠癌(COAD)、食管癌(ESCA)、头颈部癌(HNSC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肺磷癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、胃癌(STAD)和子宫内膜癌(UCEC)中表达升高，并且与正常组织相对差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2FOXP3与CESC临床特征的分层分析 根据以上结果显示，FOXP3在CESC中的表达相对于正常组织显著升高，为了进一步探讨FOXP3在CESC亚组中的相对表达信息，本研究通过UALCAN网站进行分层分析。研究结果显示：FOXP3在CESC中的表达水平〔1.999(1.000～3.845)〕显著高于正常组〔0.234(0.148～0.317)，P<0.001〕；CESCⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级的FOXP3表达水平〔2.181(1.193～3.862)、2.392(0.944～4.674)、1.465(0.998～3.585)、1.028(0.602～1.913)〕均高于正常组(P<0.001)，Ⅰ级和Ⅱ级的表达水平高于Ⅲ级和Ⅳ级(图2)；并随着淋巴结转移，FOXP3在CESC中表达呈上升趋势〔未转移2.355(1.297～4.341)、转移2.514(0.925～3.678)〕；FOXP3在非裔美国CESC患者中的表达水平〔2.917(1.410～4.901)〕明显高于高加索患者〔1.973(0.977～3.487，P<0.001〕，非裔美国CESC患者FOXP3表达水平高于亚洲患者〔1.665(1.038～4.113)〕，但差异无统计学意义。此外，FOXP3在CESC患者中的表达水平还与患者体重和肥胖有关〔正常体重1.872(0.938～3.467)、超重2.264(1.060～3.599)、肥胖1.942(1.116～2.796)、超肥1.499(1.071～3.822)，P<0.001〕，并随着年龄的增加，FOXP3在CESC中的表达水平呈上升趋势〔≤40岁1.842(1.042～2.838)、41～60岁1.949(0.943～3.499)、61～80岁2.460(1.248～3.933)，均P<0.001；>80岁0.540(0.401～3.692)，P=0.394〕。

2.3FOXP3的表达水平与CESC患者的生存率 通过来自TCGA数据库的临床信息，本研究将FOXP3在不同肿瘤中的表达水平根据均值将FOXP3分为高表达组和低表达组，使用R语言的“COX”包计算FOXP3表达水平与CESC患者总体生存率的影响，绘制生存曲线图和森林图。如图2所示，FOXP3高表达组增加CESC患者的总体生存率(P=0.004)，表明在CESC患者中，FOXP3表达水平高的患者预后较好。

2.4FOXP3与肿瘤的肿瘤突变负荷(TMB)和微卫星不稳定性(MSI) TMB和MSI是多种肿瘤的有效预后标志物和免疫治疗反应指标。本研究通过R3.6.0绘制雷达图对泛癌进行TMB和MSI分析，如图3所示，本研究未发现FOXP3与CESC的TMB和MSI有关。

2.5FOXP3与免疫细胞浸润 通过R3.6.0语言的“estimate”包计算FOXP3来自TCGA数据库中CESC的免疫细胞得分和基质细胞得分。研究发现：FOXP3与CESC免疫细胞得分呈正相关(r=0.78，P<0.001)；FOXP3与CESC基质细胞得分呈正相关(r=0.56，P<0.001)。进一步分析FOXP3表达水平与免疫浸润细胞的相关性。发现FOXP3表达水平与CESC中的B细胞(r=0.546，P<0.001)、树突细胞(r=0.494，P<0.001)、巨噬细胞(r=0.302,P<0.001)、中性粒细胞(r=0.409,P<0.001)、CD4+T细胞(r=0.478,P<0.001)、CD8+T细胞具有显著相关性(r=0.327,P<0.001)。

ACC:肾上腺皮质瘤; CHOL:胆管癌; DLBC:弥漫大B细胞淋巴瘤; GBM:胶质母细胞瘤;KICH:肾细胞癌; KIRP:肾乳头状细胞癌; LAML:急性粒细胞白血病; LGG:低级别脑胶质瘤;LIHC:肝细胞癌; LUAD:肺腺癌;MESO:间皮瘤; OV:卵巢浆液性囊腺癌;PAAD:胰腺癌; PCPG:嗜铬细胞瘤和副神经节瘤; SARC:肉瘤; SKCM:皮肤黑色素瘤; TGCT:睾丸生殖细胞瘤; THCA:甲状腺癌; THYM:胸腺瘤; UCS:子宫癌肉瘤; UVM:葡萄膜黑色素瘤。蓝色：代表FOXP3在正常组织中的表达量；红色：代表FOXP3在肿瘤组织中的表达量；1)P<0.05；2)P<0.01，3)P<0.001，图3同图1 FOXP3在肿瘤组织中表达

左：FOXP3表达水平与CESC总体生存率；右：FOXP3表达水平与泛癌总体生存率森林图图2 FOXP3表达水平与肿瘤的总体生存率

TMB：是指每一百万个碱基中有多少个碱基发生突变；MSI：是指每百万碱基中重复序列的缺失或插入的总发生率图3 FOXP3表达水平与泛癌的TMB和MSI的相关性

3 讨 论

近年来，随着CESC筛查手段的普及及HPV疫苗的广泛使用，CESC的发病率和死亡率有下降趋势，但每年仍有多数女性患者死于CESC〔7〕。本研究结果显示：FOXP3表达水平与CESC患者肿瘤分期和淋巴结转移密切相关，FOXP3在非裔美国CESC患者中的表达水平显著高于高加索患者，此外，过度肥胖和超重CESC患者的FOXP3表达水平相对于正常体重患者显著升高，并随着患者年龄增长，其表达水平逐渐升高，而由以上结果显示，年龄81～100岁的CESC患者表达水平反而降低，可能是由于其该年龄段的CESC患者样本量太小所致，由以上研究结果发现FOXP3表达水平升高促进CESC的发生。结果显示FOXP3表达水平越高，CESC患者的总体生存率越好。经查阅文献，发现相似的研究结论也存在于其他癌症中。Seminerio等〔8〕发现FOXP3在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者的间质细胞中的表达明显高于实体肿瘤，并且FOXP3表达水平越高，HNSCC患者的预后越好。Kuwahara等〔9〕发现FOXP3高表达提高结直肠癌患者的预后。然而，在一项关于FOXP3与宫颈鳞状细胞癌的研究中，高浸润FOXP3与CESC患者的预后不良有关〔10〕，但在宫颈腺癌中，FOXP3表达水平越高，预后越好〔11〕。与宫颈鳞状细胞癌的结果相反。由此可见，FOXP3与癌症预后、肿瘤部位、组织类型密切相关。

TMB和MSI两者有效反映肿瘤的预后生物标志物和治疗指标。在本研究中，尚未发现FOXP3表达水平与宫颈癌TMB和MSI的相关性，但在HNSCC和LUSC等肿瘤中，FOXP3表达的水平与TMB和MSI显著相关。FOXP3是Treg细胞最具特征性的标志物，在自身免疫性疾病和肿瘤免疫逃逸中起着重要的作用〔12〕。

综上，FOXP3在CESC中表达水平相对于正常组明显升高，然而在CESC组中，FOXP3表达水平越高，总体生存率越好。一项关于FOXP3与癌症预后的meta分析研究显示：FOXP3在大多数肿瘤中的预后差，对胰腺癌和卵巢癌的预后无影响，而HNSC、结直肠癌和ESCA中，FOXP3的浸润与预后良好有关〔13〕。本研究通过生物信息学研究FOXP3对CESC预后的影响与Shah等〔10〕研究者的结论存在争议，可能是样本来源、组织类型等因素的影响。本研究存在以下不足：研究数据均来自TCGA公共数据库，人群选择，组织类型等异质性大，未进行临床样本实验验证，可能与其他研究存在争议。