丝胶通过调节miR-346表达对高糖致足细胞损伤的保护作用

陈程 史硕 麻雯熠 刘东慧 陈志宏

(1承德医学院，河北 承德 067000；2石家庄医学高等专科学校)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，早期即可出现蛋白尿〔1,2〕。目前，DN的发病机制虽尚未明确，但研究发现肾小球滤过屏障的结构或功能异常，对最终进展为蛋白尿和肾衰竭具有重要影响〔3,4〕。足细胞作为肾小球滤过血浆的最后屏障，在保持屏障的完整性及预防蛋白尿方面发挥着重要作用。微小RNA(miRNA)可通过特异性识别并结合目的信使RNA(mRNA)3′端非翻译区，诱导mRNA降解或阻滞蛋白质翻译过程，起到转录后调控基因表达的作用〔5,6〕。miR-346是miRNA家族中的一员，有研究发现其可参与众多疾病的炎症反应过程，并在DN时呈现低表达状态〔7〕，这提示miR-346可能在DN的发生发展中发挥着重要作用。丝胶是从蚕茧中提取的一种天然水溶性蛋白，前期研究发现其能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖，并对糖尿病时肾脏损伤具有保护作用〔8,9〕，但具体机制尚不清楚。本研究探讨丝胶是否通过调控miR-346的表达来发挥对高糖致足细胞损伤的保护作用。

1 资料与方法

1.1材料 条件永生化小鼠足细胞(MPC)细胞株(上海中乔新舟生物科技有限公司)；丝胶(美国Sigma公司)；RPMI1640无糖培养基(武汉普诺赛科技有限公司)；PCR引物(miR-346、β-actin)、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、mRNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量扩增试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；PCR引物〔白细胞介素(IL-18)，宝生物工程(大连)有限公司〕；兔抗Nephrin单克隆抗体(美国Abcam公司)；兔抗GAPDH单克隆抗体(美国ABclonal公司)；山羊抗兔IgG二抗(北京义翘神州科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；小鼠IL-18酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国RayBiotech公司)。

1.2实验方法

1.2.1观察丝胶对高糖致损伤足细胞中Nephrin、miR-346、IL-18表达的影响及确定丝胶保护作用的最佳剂量

1.2.1.1细胞培养 将条件永生化小鼠足细胞培养在含5.5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清、1%青链霉素、50 U/ml γ-干扰素的RPMI1640无糖培养基中，先置于33℃、5%二氧化碳培养箱中增殖传代，再将传代的足细胞用不含γ-干扰素的RPMI1640无糖培养基在37℃、5%二氧化碳培养箱中继续培养7～14 d诱导其分化，待分化成熟后用于后续试验。

1.2.1.2细胞分组 将处于对数生长期的成熟足细胞随机分为6组：正常组(NG组：5.5 mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(MG组：5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、高糖组(HG组：30 mmol/L葡萄糖)、丝胶低剂量治疗组(LS组：30 mmol/L葡萄糖+150 μg/ml丝胶)、丝胶中剂量治疗组(MS组：30 mmol/L葡萄糖+300 μg/ml丝胶)，丝胶高剂量治疗组(HS组：30 mmol/L葡萄糖+600 μg/ml丝胶)，同步化处理12 h后，按上述条件给药培养48 h。

1.2.1.3Western印迹检测各组足细胞Nephrin蛋白表达 将各组足细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1)于冰上裂解30 min，用细胞刮轻轻刮取细胞制备细胞悬液后，于4℃环境中12 000 r/min离心15 min，收集的上清即为足细胞总蛋白。将提取的总蛋白定量后取30 μg上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，封闭后一抗(稀释比例：Nephrin 1∶1 000，GAPDH 1∶10 000)、二抗(稀释比例1∶10 000)室温摇床分别孵育2 h，洗膜后显影并应用Quantity One-v4.6.2软件计算Nephrin蛋白与GAPDH条带灰度值的比值，结果作为Nephrin蛋白的相对表达水平。

1.2.1.4Real time PCR法检测各组足细胞IL-18及miR-346 mRNA的表达 将各组足细胞用PBS清洗后，分别提取miRNA(裂解液MZ)和总RNA(裂解液RL)，测定纯度和浓度后反转录成cDNA。以各组足细胞的cDNA为模板，利用Real time PCR法扩增miR-346、IL-18及β-actin片段，得到各目的mRNA的循环数(CT值)、扩增曲线及溶解曲线。采用2-ΔΔCt法对结果进行统计学分析，结果作为miR-346及IL-18 mRNA的相对表达水平。

1.2.1.5ELISA法检测各组足细胞IL-18蛋白的表达 取各组足细胞上清液，按小鼠IL-18 ELISA试剂盒说明书进行检测，最终用酶标仪测定450 nm处的吸光度值后计算出对应浓度，结果作为IL-18蛋白的相对表达水平。

1.2.2观察丝胶是否通过调控miR-346的表达发挥对高糖致损伤足细胞的保护作用

1.2.2.1细胞培养 方法同1.2.1.1。

1.2.2.2采用miR-346抑制剂(MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor)转染足细胞并分组 根据1.2.1.3、1.2.1.4及1.2.1.5的结果，确定丝胶的最佳作用浓度为600 μg/ml。采用miR-346抑制剂MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor转染足细胞，将分化好的足细胞随机分为正常(NG1)组、高糖(HG1)组、丝胶治疗(HS1)组、miR-346抑制剂(MI)组及miR-346抑制剂对照(MIC)组。将MI组及MIC组足细胞种于六孔板中，在含600 μg/ml丝胶无血清无双抗的培养基中分别按10∶1、50∶1及50∶1的比例加入Lipofectamine®2000 Reagent、MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor及MicrOFF mmu-miR-346-5p control混匀后分别标记为溶液①、②、③，室温孵育5 min后，将溶液②、③分别按1∶1的比例与溶液①混匀后分别加入MI组及MIC组足细胞的6孔板中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48 h，NG1组、HG1组及HS1组足细胞分别采用含5.5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖+600 μg/ml丝胶的无血清无双抗培养液培养，时间及培养条件同MI组及MIC组。

1.2.2.3Real time PCR法检测各组足细胞IL-18 mRNA的表达 方法同1.2.1.4。

1.2.2.4ELISA法检测各组足细胞IL-18蛋白的表达 方法同1.2.1.5。

1.3统计学处理 采用IBM SPSS Statistics21.0软件，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1丝胶对高糖致损伤足细胞中Nephrin、miR-346、IL-18表达的影响及丝胶保护作用的最佳剂量

2.1.1各组足细胞Nephrin蛋白的表达 HG组足细胞Nephrin蛋白表达较NG组明显降低(P<0.05)；MG组足细胞Nephrin蛋白表达与NG组相比无明显差异(P>0.05)；LS、MS及HS三组足细胞Nephrin蛋白表达较HG组均明显升高(P<0.05)。见图1、表1。

2.1.2各组足细胞miR-346 mRNA表达 NG、MG及HG三组足细胞miR-346 mRNA表达无明显差异(P>0.05)；LS、MS及HS三组足细胞miR-346 mRNA表达较HG组均明显升高(P<0.05)，且LS、MS、HS三组足细胞miR-346 mRNA表达依次升高，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.1.3各组足细胞IL-18的表达 与NG组足细胞相比，HG组IL-18蛋白及mRNA表达均明显升高(P<0.05)，MG组IL-18蛋白及mRNA表达均无明显差异(P>0.05)；与HG组足细胞相比，LS、MS及HS三组IL-18蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.05)，且LS、MS、HS三组IL-18蛋白及mRNA表达依次降低，两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2采用miR-346抑制剂(MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor)转染足细胞后，IL-18的表达 NG1、HS1、MIC三组间及HG1、MI两组间足细胞IL-18蛋白及mRNA表达均无明显差异(P>0.05)；HG1及MI组足细胞IL-18蛋白及mRNA表达较NG1组均明显升高(P<0.05)；HS1及MIC组足细胞IL-18蛋白及mRNA表达较HG1及MI组均明显降低(P<0.05)。见表2。

表1 各组足细胞Nephrin蛋白、miR-346 mRNA、IL-18 蛋白及mRNA表达

表2 miR-346抑制剂转染足细胞后各组足细胞 IL-18表达

3 讨 论

DN出现肾脏损害的早期临床表现之一是微量蛋白尿，这提示肾小球滤过屏障已受损，通透性发生了改变。肾小球滤过屏障包括内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞三层，其中足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分，其结构或功能受损与蛋白尿的发生密切相关，因此许多学者也将DN归为“足细胞病”〔10，11〕。足细胞是一种高度分化的上皮细胞，由细胞体、初级突起和足突三部分组成，相邻足突间有裂孔隔膜(SD)相连，水和小分子物质可自由通过SD，但蛋白质等大分子物质却被阻拦。研究发现在高糖刺激下，足细胞会出现肥大、数目减少及足突融合等病理变化，导致肾小球滤过屏障的通透性增加，进而引发蛋白尿〔12，13〕。因此，本研究采用高浓度葡萄糖培养来建立足细胞损伤模型，以特异性表达于足细胞的Nephrin蛋白表达降低作为成模标准。

miRNA可通过多种信号途径介导肾脏炎症反应、足细胞凋亡及肾组织纤维化等病理过程，从而影响DN的发生发展〔14〕。miR-346是新近发现的一种miRNA，有研究通过全基因组miRNAs芯片及实时荧光定量PCR筛选后发现其在DN时呈现低表达状态，并且在采用miR-346质粒对DN小鼠治疗后发现，实验过程中小鼠血糖水平及体重无明显变化，但蛋白尿的症状却明显改善，同时实验结束DN模型小鼠肾小球组织结构的病理变化已明显改善〔7〕，这表明miR-346可能在DN的发生发展中发挥重要作用。此外，研究表明miR-346可参与人体炎症反应，并发挥负调节作用。IL-18属于白细胞介素家族，是一种重要的促炎性因子，Alsaleh等〔15〕在针对类风湿性关节炎的研究中发现，miR-346可通过调控IL-18的表达来减轻脂多糖介导的成纤维滑膜细胞的炎症反应。

DN是糖尿病微血管病变中最主要的并发症之一，据统计，近三分之一的糖尿病患者会发展为DN〔16，17〕，因此，寻找一种安全有效的治疗药物已迫在眉睫。目前临床用于治疗DN的西药虽具有明显降低血糖、血压的优势，但对DN导致的靶器官损伤的保护作用却较薄弱。随着对天然药物的深入研究，发现天然药物在防治DN及其并发症、改善全身整体状况方面表现出一定的优势。丝胶是蚕茧中的一种天然水溶性蛋白，主要由18种氨基酸组成，分子结构中羟基、羧基和氨基等强极性侧基的氨基酸占绝大多数，具有生物相容性可生物降解〔18，19〕。我国民间早有开水浸泡蚕茧后温服用以辅助控制血糖的经验方法，课题组前期研究亦发现丝胶对2型糖尿病大鼠肾脏损伤具有保护作用，但具体机制仍需深入探讨。本研究提示丝胶对高糖致损伤足细胞的保护作用可能与提高miR-346的表达而抑制炎症反应有关。本研究结果表明丝胶可通过提高miR-346的表达来抑制IL-18的表达进而减轻足细胞炎症反应，从而对高糖所致的足细胞损伤起保护作用。丝胶对高糖所致足细胞损伤的保护作用机制可能还有很多种途径，有待进一步研究。