基于体外法评估稻草尾菜混贮饲料与精料的组合效应

李 闯，陈 宁，张振斌，陈逸飞，于 翔，王梦芝*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子 832000）

伴随着农业现代化的发展，我国农业生产效率不断提高，同时产生了大量秸秆、尾菜等废弃物。2020年我国的蔬菜产量达到74 912.90 万t，按照20%～67%计算废弃物的产量，大约产生14 982.58 万～50191.64万t 的蔬菜尾菜。蔬菜尾菜富含维生素等营养物质，若不合理利用，会造成严重的资源浪费。研究表明，秸秆与尾菜混合青贮可以得到品质较优的青贮饲料，能够有效降低干物质损失率和pH，并且可以调控微生物菌群结构。Partovi 等研究表明，西兰花副产物和麦秸（69:31）混贮饲喂对法山德羔羊生产性能、血液生化指标、瘤胃发酵参数没有影响，说明该混贮饲料可以饲喂法山德羔羊。

本课题组前期研究结果已表明，稻草秸秆与白菜尾菜的混贮比例为4:6 时有较好的发酵品质和较高的营养价值。研究认为，饲料间组合效应是调控瘤胃发酵的重要措施。在生产中发现，稻草尾菜混贮饲料（下称“混贮饲料”）搭配精料共同使用有一定组合效应。但混贮饲料与精料的组合使用效应还未进行估测。因此，本试验旨在研究不同比例的精料与混贮饲料对体外产气及体外瘤胃发酵的影响，为混贮饲料在育肥湖羊上的饲养提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 精料（玉米、豆粕、麦麸）购自扬州大学饲料厂。混贮饲料按照本课题组前期试验方法制作完成：稻草秸秆和白菜尾菜质量比为4:6，以植物乳杆菌（0.035 g/kg）与纤维素酶（0.250 g/kg）作为添加剂，混贮时间为45 d。混贮完成后在65℃下烘干成风干样，粉碎后过40 目筛用于测定营养成分。参照《饲料检测与分析实验技术》测定精料与混贮饲料中干物质（DM）、粗灰分（Ash）、粗蛋白质（CP）、钙（Ca）、磷（P）、酸性洗涤纤维（ADF）以及中性洗涤纤维（NDF）含量。

1.2 试验动物 选取5 只健康状况良好、体况相近、装有永久性瘘管的育肥湖羊，在扬州大学动物房单圈饲养。燕麦草、苜蓿为粗饲料，补饲玉米（80%）和豆粕（20%），精粗比为4:6。每日7:00 和19:00 各饲喂等量饲料并且自由饮水。

1.3 瘤胃液采集 在晨饲前，采集瘤胃液，每只湖羊所采瘤胃液不超过500 mL。瘤胃液迅速经过4 层纱布过滤至保温瓶（经过39℃热水预热后充满CO气体）。随后将保温瓶迅速带回实验室，并持续通入CO。

1.4 人工唾液制备 根据Menke 等的方法配制人工唾液（A、B、C）、还原剂（NaOH 和NaS·9HO）和刃天青。

1.5 试验设计

1.5.1 体外发酵批次培养试验 将精料与混贮饲料按0:100（C0 组）、30:70（C30 组）、50:50（C50 组）、70:30（C70 组）、100:0（C100 组）的比例混合均匀后作为发酵底物，原料组成及营养成分见表1。5 组分别称取0.5 g 精料与混贮饲料的混合底物于不同100 mL发酵瓶内，每组设置5 个时间点（4、8、12、24、48 h），每个时间点3 个重复。将50 mL 人工唾液和25 mL 瘤胃液迅速注入培养瓶内，立即通入CO3～5 s，立刻置于SHA-A 型恒温振荡水浴锅内进行48 h 体外发酵培养。各组日粮在培养开始后在每个时间点进行取样，用4 层纱布初步过滤出残渣并收集过滤出的培养液，将培养液分装至1 个15 mL 离心管（留存备用）和3 个2 mL 离心管，-80℃冰箱保存，用于测定氨态氮（NH-N）、微生物蛋白（MCP）、挥发性脂肪酸（VFA）含量。

表1 不同比例的精料与混贮饲料发酵底物的营养成分（干物质基础） %

1.5.2 体外发酵产气试验 在进行体外发酵批次培养试验的同时进行体外发酵产气试验。按照体外发酵批次培养试验比例，称取0.5 g 精料与混贮饲料的混合底物于不同100 mL 发酵瓶内，每组3 个重复。将50 mL 人工唾液和25 mL 瘤胃液迅速注入培养瓶内，立即通入CO3～5 s，随后用橡胶塞和螺盖盖紧，将发酵瓶通过输液器与64 路AGRS-III 型体外发酵产气自动记录装置的气路连接，39℃恒温条件下连续培养48 h。发酵结束后，用4 层纱布过滤并收集全部残渣。

1.6 体外发酵参数的测定

1.6.1 产气量和产气参数的计算 利用Ørskov 等提出的公式对各组产气量数据进行非线性曲线回归拟合：

式中，P表示发酵液在t 时间点累积产气量（mL/g DM）；参数a 表示发酵菌发酵初始时间点产气量，即快速产气部分（mL/g DM）；参数b 表示理论最大产气量，即缓慢产气部分（mL/g DM）；参数c 表示产气速率常数（mL/h），参数a 与参数b 的和（a+b）表示潜在产气量。

1.6.2 培养液发酵参数的测定 使用Mettler toledo pH计测定培养液pH；酚-次氯酸钠比色法测定培养液中NH-N 含量；三氯乙酸法测定培养液中MCP 含量；利用日本岛津GC-14B 气象色谱仪内标法测定培养液VFAs 含量，并计算TVFA 以及乙丙比。

1.6.3 48 h 干物质降解率（DMD） 发酵液发酵48 h 后，置于冰水中进行终止发酵，并用4 层400 目尼龙布过滤发酵液。残渣在65℃下烘干24 h，记录残渣重量，用于计算DMD。

1.6.4 组合效应的评估公式

加权估算值=C0 组测定值× 混贮饲料的比例+C100 组测定值×精料的比例

单项组合效应指数（SFAEI）=100% ×（实际测定值-加权估计值）/加权估算值

1.7 统计分析 试验数据采用Excel 2016 记录并进行基础整理，采用SPSS 20 软件中的ANOVA 模块进行单因素方差分析，运用Duncan's 法进行多重比较。＜0.05表示差异显著，＞0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外发酵产气参数及DMD 的影响 由表2 可知，5 组的快速产气量之间存在显著性差异，其中以C0 组最高，C50 组最低。此外，C50 组和C100 组的快速产气量出现负值。C70组和C100 组的理论最大产气量、潜在产气量、累积产气量高于C0 组、C30 组、C50 组（＜0.05）。C0 组、C50 组和C70 组的理论最大产气量、潜在产气量、累积产气量随精料比例的提高而升高（＜0.05）。此外，DMD 随着精粗比的增加而升高，C100 组DMD 高于其他组（＜0.05）。

表2 精料与混贮饲料不同比例对48 h 体外发酵产气参数及DMD 的影响

2.2 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外瘤胃发酵液pH 的影响 由表3 可知，各组培养液pH 随着时间的延长而降低，并且随着混贮比例降低而越小。在8、24、48 h 时，培养液pH 随着精粗比的增加降低（＜0.05）；培养12 h 时，除C50 和C70 组差异不显著，其他各组差异显著。

表3 精料与混贮饲料不同比例对48 h 体外瘤胃发酵液pH 的影响

2.3 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外发酵液NH-N 的影响 由表4 可知，不同比例的精料与混贮在体外发酵期间NH-N 浓度在7.65～55.82 mg/dL。在8、12 h 时，C0 组和C30 组高于C70 组和C100 组（＜0.05）；24 h 时，C0～C70 组高于C100 组（＜0.05）；48 h 时，C30 组、C50 组、C70 组差异不显著，但高于C0 组和C100 组（＜0.05）。

表4 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外发酵液NH3-N 的影响 mg/dL

2.4 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外发酵液MCP 的影响 由表5 可知，各组MCP 含量随着体外发酵时间增加而升高。12 h 和24 h 时，C50 组、C70组高于C0 和C30 组（＜0.05）；48 h 时，C0 组高于C30 组（＜0.05）。

表5 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外发酵液MCP 的影响 mg/dL

2.5 不同比例的精料与混贮饲料对体外发酵液VFA 的影响 由表6 可知，在8、24、48 h 时，随着精粗比增加，TVFA 浓度和丁酸比例呈升高趋势。培养12、24、48 h 时，C50 组、C70 组 和C100 组TVFA 浓 度差异不显著，但均高于其他组（＜0.05）。培养8 h 时，C50组和C70 组乙酸比例高于C100 组（＜0.05）；从12 h到48 h，随着精料增加，乙酸比例减少（＜0.05）。培养4 h 时，C50 组和C70 组丙酸比例差异不显著，但二组高于C100 组（＜0.05）；培养8 h 时，C70 组高于C50 组（＜0.05）。培养4、8 h 时，C100 组丁酸比例高于C0 组（＜0.05）；培养12、24、48 h 时，C100 组丁酸比例高于其余各组（＜0.05）。培养4 h 时，C100组乙酸/丙酸高于C50 组（＜0.05）；培养24、48 h 时，C50 组高于C70 组（＜0.05）。

表6 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外发酵液VFA 的影响

2.6 精料与混贮饲料不同比例的组合效应 由表7 可知，对于SFAEI 而言，3 组MCP 都存在负组合效应；C30组累积产气量、C70 组pH 和NH-N 存在负组合效应；C50 组和C70 组的累积产气量存在正组合效应，C30 组和C50 组的pH 和NH-N 存在正组合效应。此外，3 组的TVFA 和DMD 都存在正组合效应。3 组MFAEI 均为正组合效应，但以C50 组MFAEI 最高。

表7 精料与混贮饲料不同比例的组合效应

3 讨 论

3.1 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外发酵产气参数的影响 体外发酵产气量能够反映饲料在瘤胃内的发酵程度及消化程度，体外产气量越高，说明该日粮的可利用程度越高。瘤胃对饲料降解所产生的气体主要源于瘤胃微生物对饲料内蛋白质含碳部分以及碳水化合物的降解，快速降解产气量表示在饲料发酵前期可降解部分，其大小与该阶段可发酵成分的含量呈正相关，亦与CP 含量正相关。在本试验中，快速降解部分并未与CP 含量呈明显的正相关关系并且出现了负值，可能是因为培养液发酵前期出现产气延迟，信号接收点不稳定，随后逐渐稳定，在拟合过程中出现负值。此外，本试验结果表明，随着精料增加，体外产气量也随之增加。这可能是由于随着精料的增加，瘤胃内产气微生物菌群的数量随之增加。此外，随着精料比例的增加，CP 含量逐渐增加，为微生物的发酵提供了充足的氮源，也可能是产气量增加的另一个原因。前人研究表明，产气速率与日粮中精料的比例呈正比。但在本试验中，并未呈明显的关系，这可能是由于在精料与混贮饲料混合同时进行发酵的情况下，发酵先后顺序不同导致。本试验中，DMD 随着精料比例的增加而提高，可能是因为精料更加有益于瘤胃微生物的增殖，从而提高了DMD。

3.2 不同比例的精料与混贮饲料对48 h 体外瘤胃培养液发酵参数的影响 瘤胃液pH 在一定程度上可以反映瘤胃发酵情况，与日粮组成、瘤胃内有机酸的浓度、唾液分泌量等因素相关。瘤胃液pH 正常变化范围在5.5～7.5，过高或过低均会影响瘤胃内微生物生长、繁殖以及瘤胃发酵。本试验中，不同精粗比对各时间点的pH 均产生了显著影响，并且pH 随着精粗比的提高而降低。这是由于随着精料的增加，CP 含量增加，NDF 和ADF 含量降低，积累了大量VFA，降低了瘤胃内环境pH。

瘤胃内NH-N 源于内源性含氮物质或外源性含氮物质的降解，也是合成MCP 的主要物质，可以在一定程度上反映瘤胃微生物对含氮物质利用情况。如果NH-N 浓度较高，微生物无法及时合成MCP，就会造成能量损失；若浓度较低则所合成MCP 无法满足机体需求，会降低营养物质的利用率。有研究表明，瘤胃内NH-N 浓度的正常变化范围在0.35～29 mg/dL。本试验结果表明，发酵48 h 时，NH-N 浓度已经超出瘤胃正常范围，这可能是在培养过程中没有将代谢物外移，从而使NH-N 不断积累。此外，发酵12 h 之后，除C0 组，随着精料比例的增加，NH-N 浓度呈降低趋势。原因可能是饲料中非碳水化合物含量升高，促进瘤胃微生物生长繁殖，提高NH-N 利用效率。在发酵12 h 内，规律尚不明显，这可能是因为瘤胃微生物还在适应这类饲料。在发酵48 h 时，C30 组、C50 组和C70 组之间差异不显著，说明30%～70%混贮饲料与精料的组合对NH-N 浓度无影响。

瘤胃内微生物可以利用饲料降解产生氨基酸、肽等作为氮源合成MCP，为反刍动物的生命活动提供40%～80%的蛋白质。NH-N 是合成MCP 的前体物质，MCP 与NH-N 密切相关。王仁杰等以阉割南江黄羊作为瘤胃液供体动物，发现MCP 浓度并没有随着精粗比（30:70、50:50、70:30）的增加而增加，其中50:50 组、70:30 组显著高于30:70 组，50:50 组、70:30组之间差异不显著。在本试验中，培养48 h 时，C0 组MCP 含量显著高于C30 组，可能是因为增加精料的比例提高了瘤胃微生物分解MCP 生成NH-N 的能力。

日粮中碳水化合物在瘤胃中的发酵终产物是VFAs，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。TVFA 以及VFAs能够反映饲料在瘤胃中的利用效率和瘤胃发酵方式。本试验中，在发酵各个时间点，TVFA 浓度与精粗比呈正比，这是因为随着精料比例的增加，饲料中纤维类物质含量随之降低，有利于微生物生长繁殖，从而增加TVFA 含量。但随着精料比例增加，乙酸比例会有所下降。乙酸比例与日粮中NDF 含量呈高度正相关，以混贮饲料作为单一粗饲料也符合这一发酵特性。一般认为，提高日粮中精料比例，可以提高丙酸、丁酸比例，而降低乙酸/丙酸。在本试验中，丙酸比例在发酵4 h时含量较高，可能是因为混贮饲料的有机物含量较高且消化速度更快。但随着发酵的进行及精料作用的发挥，精粗比占据主导作用，但由于混贮中部分可溶性糖之类的物质占比较高，导致最终丙酸比例有所增加。此外，乙酸/丙酸的范围在1.82～2.79，均属于乙酸发酵。

3.3 精料与混贮饲料不同比例的组合效应 不同饲料组合之间会产生不同组合效应，组合效应分为SFAEI 和MFAEI。SFAEI 是从单一方面衡量饲料营养价值，难以做出全面评价；而MFAEI 综合多个指标对饲料进行评价，具有一定参考价值。本试验综合考虑发酵48 h累积产气量、pH、NH-N、MCP、TVFA 以及DMD 6个指标进行计算分析组合效应值，发现3 组日粮均出现了正组合效应，可能是因为混贮饲料与精料达到适宜比例，经过瘤胃微生物的作用，各种营养物质之间以及非营养物质之间互作效应增加了饲粮的发酵作用，提高了日粮发酵效果。

4 结 论

本研究结果表明，混贮饲料与精料的组合能够改善体外瘤胃发酵特性，即存在正组合效应，其中C50 组的组合效应值最高，即混贮饲料与精料的最佳比例是50:50。